HBV感染者IL?18基因转录水平及其血清中含量检测的临床意义
作者：董萍 高露 彭海英 马伟军 赵洪礼
【摘要】 目的 探讨白细胞介素18(IL?18)在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的作用。方法 从68例HBV感染者(无症状携带者15例，慢性肝炎患者35例，重型肝炎患者18例)和24例健康体检者血液中分离出外周血单个核细胞(PBMC)及血清，应用RT?PCR及ELISA分别对IL?18基因的转录和血清中IL?18的含量进行检测。结果 不同临床类型HBV感染者之间IL?18基因转录水平的差异均有非常显著统计学意义(P<0.01)，重型肝炎组IL?18基因转录水平高于正常对照组(P<0.01)，无症状携带者组低于正常对照组(P<0．05)，慢性肝炎组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0．05)。随着病情加重，IL?18水平上升。肝组织炎症活动度不同的慢性肝炎患者之间IL?18基因转录及其血清中的含量表达水平的差异均有显著统计学意义(P<0．05)，肝组织炎症程度越重，IL?18含量越高。结论 IL?18可能参与了宿主对HBV的免疫应答，与肝脏炎症程度相关。
【关键词】 乙型肝炎病毒 白细胞介素18 基因
Abstract： Objective To evaluate the possible roles of interleukin 18 (IL?l8) in hepatitis B virus (HBV) infected individuals. Methods Peripheral blood lymphocytes from three groups of HHV infected individuals including 15 asymptomatic carriers, 35 patients with chronic hepatitis and 18 patients with fulminant hepatitis, and from 24 blood donors (as normal controls) were analyzed. The transcription and expression of IL?18 in peripheral blood monocytes (PBMC) were assessed by semi?quantitive reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) and flow cytometry. Results (1) There were significant differences in the transcription and expression levels of IL?18 among the groups of infected individuals. Interestingly, it was the highest in the fulminant hepatitis group, and the lowest in the asymptomatic carrier group. However, there was no significant difference between those with chronic hepatitis and normal controls. The severity of the disease was accompanied by the elevation of IL?18 production. (2) The severity of the liver inflammation in those with chronic hepatitis was companied by the elevation of IL?18 production. Conclusion IL?18 may take part in the host immunity against HBV, and relate to the inflammation degree of the liver.
Key words： Hepatitis B virus; interleukin?18; gene expression
细胞免疫和体液免疫是清除体内乙型肝炎病毒(HBV)的主要方式，并且以细胞免疫为主。所以参与细胞免疫的各种细胞因子的作用越来越受到重视。白细胞介素?18作为新近发现的细胞因子，在细胞免疫调节中起着重要的作用，它具有刺激INF?γ分泌、FasL表达、增强NK细胞和Th1细胞活性等功能。近年来其在病毒性肝炎损伤过程的作用日益引起重视。本研究采用RT?PCR和ELISA法测定各型乙型病毒性肝炎患者外周血单核细胞（PBMC）IL?18 mRNA转录水平和血清中IL?18含量，旨在探讨其在不同类型肝炎患者血清中的变化及其与肝功能受损的关系。
1 对象与方法
1.1 研究对象 为本院门诊体检及住院HBV感染者68例，女19例，男49例，年龄19～65(32±9)岁，其中无症状携带者15例，慢性肝炎35例，重型肝炎18例。 所有病例的诊断均符合2000年9月西安会议制定的病毒性肝炎防治方案的标准[1]。正常对照组24例为健康体检者，女8例，男16例，年龄18～37(27±6)岁，并排除合并感染其他病毒性肝炎。35例慢性肝炎患者均有肝组织病理诊断，肝脏炎症活动度分级，病理诊断及分级标准按[1]。
1.2 方法
1.2.1 PBMC分离与mRNA的提取[2] 每例受试者取血6 ml，常规分离PBMC，用于mRNA检测。采用总RNA提取试剂盒(美国Promega公司)，严格按试剂盒说明书提取。提取出的RNA用紫外分光光度仪测吸光度(A)值，并进行甲醛变性胶电泳，以确定RNA完整性及含量。
1.2.2 RT?PCR 检测IL?18 mRNA[2] 采用反转录聚合酶链反应(RT?PCR)技术。IL?18基因引物和内参照肌动蛋白引物由本实验室自行设计，由上海生物工程公司合成。IL?18上游引物序列为：5′?CGGAATTCATGTACTTTGGCAAGCTT?3′,下游为：5′?CGGGATCCCTAGTCTTCGTTTTG?3′扩增产物490bp。内参照β?肌动蛋白上游引物序列为5′GATCGCTTCCTCGCAACAAACTA 3′，下游引物序列为5′ACTGTAGAGATATAATGGACCCCGGAC3′，扩增产物174 bp。应用一步法RT?PCR试剂盒(大连宝生物公司)，反应体系：10×Buffer 5 μL，25 mmol/L Mgcl2 10 μL ，10 mmol/L dNTP 5 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV RTase XL 1 μL，AMV?Optimized Taq 1 μL，Specific upstream PCR Primer 1 μL，Specific downstream PCR Primer 1 μL，Positive control RNA 2 μL，RNase Free Water 23 μL， 总体积50μL。反应参数：反转录为50 ℃ 30 min﹑94 ℃ 2 min；PCR为94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30个循环，于72 ℃ 延伸7 min。取PCR产物5 μL 进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据其Mr作出初步判断。应用Molecular Analysl图像分析软件对条带进行吸光度峰值下面积积分，IL?18与8 肌动蛋白积分之比，即为IL?18 mRNA相对水平。
1.2.3 血清中IL?18蛋白含量检测 IL?18检测试剂盒为进口分装，购于上海晶美生物工程有限公司。采用双抗体夹心ELISA法，操作按试剂盒说明书进行。酶标仪为BIO?RAD 550。
1.3 统计学处理 不同临床类型及不同肝组织炎症活动度患者组间比较采用单因素多水平设计资料的方差分析及最小显著性差异检验；慢性肝炎患者IL?18转录水平与肝功能生化指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清总胆红素(TB)、血清白蛋白(Alb)相关性采用直线相关分析；PBMC中IL?18 mRNA表达与血清中IL?18含量的相关性采用直线相关分析。采用SPSS 8.0软件进行统计。
2 结果
2.1 HBV 感染者IL?18 mRNA RT?PCR产物 根据所设计的引物，预计扩增片段的大小为490bp。1%琼脂糖凝胶电泳显示，RT?PCR产物略小于标准品中564bp的条带，大小基本符合预期的DNA片段（图1）
1.DNA Marker； 2.空白对照组；3.HBV感染者
图1 HBV感染者外周血PBMC mRNA IL?18 RT?PCR 结果（略）
2.2 各临床类型HBV感染者PBMC IL?18mRNA转录水平（IL?18/β肌动蛋白积分比值）及血清中IL-18含量比较结果见表1。不同临床类型之间PBMC IL?18基因转录水平的差异均有显著统计学意义(P<0.01)，病情越重，IL?18转录水平越高。重型肝炎组IL?18基因转录水平高于正常对照组(P<0．01)；无症状携带者组低于正常对照组(P<0.05)；慢性肝炎组虽然高于正常对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 不同临床类型的HBV感染者PBMC IL?18基因的转录水平及血清中IL?18含量比较（略）
与正常对照组比较，①P<0.05,②P<0.01,③P>0.05；与无症状携带者比较，④P<0.01；与慢性肝炎比较，⑤P<0.01
2.3 肝组织炎症活动度不同的慢性肝炎患者IL?18基因转录水平及血清中IL?18含量比较 结果见表2。肝组织炎症活动度分级不同的4组慢性肝炎患者之间两两比较，IL?18基因转录水平和血清中IL?18含量的差异均有显著统计学意义(P<0．05)，肝脏炎症程度越重，其基因转录水平和含量越高。
表2 肝组织炎症活动度不同的慢性肝炎患者IL?18基因的转录及表达水平（略）
与G1比较，①P<0.05,②P<0.01；与G2比较，③P<0.05；与G3比较，④P<0.05
3 讨论
HBV感染机体后，机体主要靠特异性的免疫反应清除病毒，并且以细胞免疫为主。机体细胞免疫的强弱与肝细胞的损伤程度、病情的轻重和预后密切相关：当细胞免疫较强时，肝细胞损伤较重，临床上表现急性重症肝炎，但预后较好，一般不转为慢性；相反，当细胞免疫较弱时，尽管肝细胞损伤较轻，临床表现为轻症肝炎，但预后较差，多转化为慢性活动性肝炎、肝硬化，甚至诱发肝癌。所以细胞免疫反应强弱决定了乙型肝炎的转归。
报道IL?18参与乙型肝炎的免疫应答[3～4]。IL?18是一种新发现的免疫调节因子，主要参与宿主抗细胞内感染和肿瘤免疫。IL?18 mRNA可以在PBMC的各种亚群中表达，在炎症反应中以单核巨噬细胞表达为主。IL?18通过激发γ干扰素(IFN?γ)的表达与合成，促使原始辅助性T细胞(ThO)向I型辅助性T细胞(Th1)转化，促进Thl增殖，进一步诱导分泌IFN?γ、IL?2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等，形成由IL?18、Thl细胞因子组成的细胞因子级联；IL?18还可以上调FaaL(Fas配体)在T细胞、杀伤(INK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的表达，增强FasL介导的细胞毒效应。研究HBV感染患者IL?18的活性，有助于了解机体的免疫状态，对乙型肝炎的有一定的指导意义。
本研究结果显示，无症状携带者IL?18基因的转录、表达低下，血清中IL?18的含量也相应低下，这可能与其持续感染状态有关，因为血清中低水平IL?18不能有效地促进Thl应答，影响了体内的病毒清除。Manlyama等[5]的研究表明，无症状携带者Th1功能减退，呈病毒高复制状态，Th2应答占优势，与我们的结果相符。慢性肝炎组IL?l8基因的转录虽然并未降低，但呈持续感染状态。Kobayashi等[6]曾报道慢性乙型肝炎患者体内产生IFNβ的Th细胞数并不低于正常人，但产IL?4 的Th细胞数比正常人高，推测慢性乙型肝炎患者体内可能有某些因素影响Thl细胞的作用。重型肝炎组IL?18基因的转录、表达及血清中IL?18含量明显高于慢性肝炎组和正常对照组，所以我们认为尽管IL?18可能通过增强机体细胞免疫，造成肝细胞的免疫损害，但对清除体内HBV、防止HBV感染慢性化、促进乙型肝炎痊愈具有积极作用。
【文献】
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