PolyI：C诱导C57BL/6小鼠产生自身免疫样病变
作者：蒋廷旺，吴传勇，张玲珍，陈燕，周晔，朱烨，谷明莉，陈波，邓安梅，仲人前
【摘要】 目的 探讨聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid，PolyI：C)注射C57BL/6小鼠产生的血清学和组织学自身免疫现象。方法 50只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为药物组和对照组，药物组按5 mg/kg 剂量注射PolyI：C，对照组注射无菌PBS，每月每组取5只实验小鼠眼眶采血，间接免疫荧光法测定血清抗核抗体(ANA)和抗线粒体抗体(AMA)。同时取小鼠肝脏做HE染色，显微镜观察病理改变。结果 PolyI：C组小鼠血清AMA阳性率逐渐增高，第4月达到80%，此后维持不变，对照组只有1例出现AMA弱阳性。PolyI:C组ANA阳性率在第2月达到100%，对照组随着时间的进行也出现ANA阳性，在第4月达到100%；HE染色发现药物组小鼠肝脏汇管区及部分血管周围均出现不同程度的炎细胞浸润。结论 PolyI：C注射C57小鼠可以刺激机体产生自身抗体ANA，AMA，并引起肝脏炎细胞浸润，产生自身免疫样病变，有发生自身免疫性肝病倾向。
【关键词】 聚肌苷酸胞苷酸；抗核抗体；抗线粒体抗体；自身免疫
聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid，PolyI：C)是TLR3的配体，在自身免疫性疾病的发生、中发挥重要的生物学作用[1~2]。Polyl：C可以诱导机体产生Ⅰ型干扰素(IFN?α)，刺激机体产生多种抗体，其中包括部分自身抗体[3]。本研究以一定剂量的PolyI：C腹腔注射C57BL/6小鼠，观察小鼠产生的自身免疫反应，为进一步建立自身免疫病动物模型奠定基础。
1 材料和方法
1．1 实验材料 C57BL/6小鼠6周龄50只，每只约20 g，购自第二军医大学动物房，随机分为PolyI：C组和对照组，超清洁级(SPF)条件下饲养；PolyI：C(sigma公司)；自身抗体试剂盒(德国欧蒙公司)。
1.2 polyI：C的稀释与注射 用无菌PBS将PolyI：C稀释至1 mg/ml，按照5 mg/kg 剂量对PolyI：C组小鼠行腹腔注射，同时对照组小鼠注射等体积无菌PBS，每周注射2次。
1.3 血清自身抗体的测定 每月每组取5只小鼠，眼眶采血取血清，以Hepa?2细胞作为基质采用间接免疫荧光法测定其中ANA，AMA的含量，测定步骤严格按照说明书进行。
1．4 肝组织HE染色 将小鼠断颈处死后剖开腹腔，分离肝脏，然后立即放置于提前准备好的10%中性甲醛溶液中。用石蜡包埋肝组织，做成切片进行HE染色，最后在显微镜下观察染色结果，挑取染色效果理想的切片进行拍照。
2 结果
2.1 血清抗线粒体抗体（AMA）检测结果 PolyI：C组小鼠随着药物的注射血清AMA 阳性率逐渐增高，第4月达到最高峰80%，此后虽然继续注射PolyI：C但AMA阳性率不再提高。而对照组小鼠最终仅1只出现AMA弱阳性，见表1。
表1 两组小鼠不同时点血清AMA阳性率比较（略）
2.2 血清抗核抗体（ANA）检测结果 随着药物的注射，PolyI：C组和对照组小鼠血清的ANA阳性率逐渐增高，但是PolyI：C组升高速度显著高于对照组，在第2月就达到100%。此后维持不变，而对照组小鼠ANA阳性率在第4月达到100%，升高速度比较缓慢，见表2。
表2 两组小鼠不同时点血清ANA阳性率比较（略）
2.3 肝脏HE染色结果 HE染色结果表明，PolyI：C组小鼠肝组织出现不同程度的炎细胞浸润，并且浸润细胞的数量随着药物注射时间延长有所增加，另外，镜下观察后发现大量的炎细胞出现在肝内胆管周围，见图1b，另有少量出现在静脉血管外周；对照组小鼠肝脏则没有出现明显的炎性浸润，见图1a；两组小鼠均未出现肝实质性病变。
3 讨论
PolyI：C能够诱导机体产生IFN?α和部分前炎症细胞因子，而IFN?α可以刺激机体产生多种抗体，包括自身抗体，但是对于产生抗体的类型及其引起的组织病变目前国内尚无相关研究。同时有很多研究表明PolyI：C在一些自身免疫性疾病中发挥作用[4]。
图1a 对照组小鼠正常的汇管区(400×)（略）
图1 b PolyI:C组小鼠汇管区炎细胞浸润(400×)（略）
我们以PolyI：C刺激C57BL/6小鼠，观察小鼠产生的自身免疫现象。血清学变化主要体现为AMA和ANA随注射时间延长而发生的改变，其中AMA仅出现于PolyI：C组小鼠并且阳性率逐渐增高，对照组中几乎未出现AMA阳性小鼠，说明PolyI：C刺激该小鼠后能特异性产生AMA，而两组小鼠的ANA阳性率均随着注射时间延长而增高，但PolyI：C组增加的速度较对照组快，说明C57BL/6小鼠随着饲养时间的延长会自发性产生ANA，而PolyI：C可以加快此过程。组织学的异常改变主要表现为PolyI：C组小鼠肝脏小胆管和静脉血管周围出现炎细胞浸润，且随着注射时间的延长浸润的炎细胞数量明显增加。以上事实说明PolyI：C在引起小鼠产生自身抗体的同时也导致肝组织损伤，有引发自身免疫性肝病的趋势。自身免疫性肝病主要包括：自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)[5]。它们均出现不同程度的血清自身抗体升高和肝脏炎性浸润，但自身抗体的类型和肝脏损伤的部位及程度有所不同[5]。因此，本研究为建立自身免疫性肝病模型从而深入研究其发病机制奠定了良好的基础。
【】
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