目前人工韧带与组织工程韧带的研究现状
【摘要】 交叉韧带损伤后，由于其愈合能力较差，因此长期以来，对重建交叉韧带使用材料的研究从未停止过。本文主要对细胞因子在组织工程学韧带中的应用、基因转染技术在组织工程韧带研究中的应用、组织工程韧带附丽的基础研究，骨和组织工程韧带之间的愈合关系作了较详细介绍。另外，对人工合成韧带、胶原支架韧带也作了概述。
【关键词】 人工韧带；组织工程韧带
交叉韧带损伤后愈合能力极差，目前临床重建交叉韧带使用的材料包括自体移植物、异体移植物和人工合成材料。自体和异体移植物重建交叉韧带依然是目前的主流选择，常见的自体髌腱或半腱肌移植具有较高的强度，在附丽位点能够获得骨?骨或腱?骨愈合。但对自体供区会继发膝前疼痛、髌腱炎、髌下脂肪垫挛缩、相应部位髌骨骨折、绳肌缺失等并发症。异体髌腱、跟腱、阔筋膜材料存在来源少、免疫排斥反应、生物长入延迟甚至传播疾病的危险[1~2]。因此，长期以来，人工韧带的研究从未停止。而近年来，组织工程技术重建交叉韧带的实验也成了新的研究热点。
1 人工合成韧带人工韧带的研究与临床应用
经历了漫长的曲折过程。人工韧带具有无供区并发症、使用方便、早期康复、无疾病传播危险等许多明显优势。理想的材料，应该具备持续高强度、耐磨损、无组织反应等基本特性，并具有正常韧带的功能，同时允许有生理排列、再生新韧带倾向的组织逐渐长入。然而，完全符合上述条件的人工韧带尚未面世。自上世纪60年代，人工韧带已经进入临床应用。70年代后的20年，有多种类型的人工韧带被植入体内。其中有许多著名的产品，包括Gore?Tex，Leeds?Keio，Kennedy等。在材料选择上，完全合成的碳纤维韧带，因在关节和淋巴内释放磨损颗粒，引起显著的炎性反应。此后，以碳支架结合胶原或聚酯、聚四氟乙烯纤维束合成的聚合物，临床成功率均不高[3]。 涤纶和聚丙烯等带孔的纤维织物， 理论上允许周围组织迁移长入，再生具有功能的韧带，同样因不可吸收而引发显著的慢性炎症反应，引起移植物失败和断裂。在纤维织物上种植成纤维细胞后虽然可再植入体内，但减少炎症反应的作用有限。对这些合成的永久支架组织学研究显示类似瘢痕和肉芽肿。不是正常韧带的有序胶原纤维。
对早期应用人工韧带的随访研究并未显示优良结果，主要问题是早期的组织反应和晚期的磨损、松弛与断裂。因此，在经历了20年的后，人工韧带的应用趋于沉寂。然而，近年来LARS(ligament advanced reinforcement system)聚酯韧带的近期优良结果受到了关节镜与骨科运动医学领域的重视。在设计上，该韧带除了具备2 000~4 000 N的抗拉强度外，其将关节内部分以多根平行纤维排列，允许扭转和纤维长入。近期随访研究结果十分令人鼓舞：无明显滑膜炎反应，早期恢复运动，与金标准BPB的对照研究显示了相同的疗效(2年)。同时，对植入体内韧带进行的活检以及体外的实验均表明其具有较好的组织相容性且人工纤维之间有组织长入。目前，国内也已开始使用LARS韧带，我们建议使用者应该明确地知道人工韧带的优缺点，严格掌握适应证，并密切关注其远期疗效的观察结果。
2 胶原支架韧带
在认识到合成韧带的持久、不降解性质后，实验人员开始进一步研究生物学支架，其中大多数为胶原支架。使用胶原支架的韧带重建，已经产生特定位点重新塑形、在隧道附丽点成骨、韧带样过渡区及关节内区域韧带样胶原排列的可喜效果。也有人以胶原纤维或在胶原纤维上种植成纤维细胞，试图再生新韧带。这些方法的主要缺陷为胶原支架是异源的，具有相似的相关并发症。
3 组织工程韧带
Cao等[4]在无胸腺裸鼠皮下种植带有小牛肌腱成纤维细胞的聚乙醇酸支架，再生的新肌腱力学特性类似于正常小牛肌腱力学特性。Ibarra等[5]采用相似的技术，将从小牛交叉韧带提取的成纤维细胞种植在聚乙醇酸支架上后， 再种植于裸鼠背部皮下， 几周后再生出韧带样结构。在这两项研究中，随时间推移，再生组织似乎获得了与正常韧带和肌腱类似的大体和组织学特性。Ibarra[5]将两种不同细胞种植在聚乙醇酸上，在裸鼠模型上再生出韧带和骨的复合结构，该结构的中央部分为韧带样组织，最初种植小牛骨膜细胞的两端形成骨样组织，并经特定的组织学茜素红染色证实，X线分层拍片证实有矿化。这些研究提示我们能够以患者自身细胞和合成的生物降解聚合物支架，再生自体组织。
3.1 细胞因子在组织工程学韧带中的应用
韧带损伤后，存在于局部环境中的细胞因子，对于激发序列性炎症、增生和重新塑形来说是十分重要的。以细胞因子如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生生长因子(platelet?derved growth factor，PDGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)处理的韧带细胞，其增殖速度比未处理的细胞快8倍[6]。基本成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子?β l(transforming growth factor?β 1，TGF?β 1)，PDGFB，EGF和胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor，IGF)均可促进成纤维细胞的有丝分裂。联合使用bFGF，TGF?β 1，IGF，PDGF?B对兔子交叉韧带外植物生长的细胞有促进效应。体外测定细胞因子对韧带细胞的具体作用，证实EGF诱导韧带成纤维细胞的增殖，可诱导糖蛋白合成，但减少I型胶原的合成。IGF?I可刺激细胞增殖、I型胶原合成和糖蛋白合成。对于TGF?β的老鼠内侧副韧带，使其断裂的力量、强度和能量均增大，TGF?β最有希望成为促进交叉韧带生长的重要因子。经细胞因子处理的韧带细胞种植在生物降解聚合物上，可增强其增殖和基质合成能力[8]。最理想的可控制释放系统可能是将这些细胞因子直接加入生物降解聚合物上，产生一定的支架，释放韧带特异性有丝分裂，同时提供产生组织工程韧带的三维框架。
3.2 基因转染技术在组织工程韧带研究中的应用
韧带和肌腱成纤维细胞易被很多病毒和非病毒介质所转染[9~10]，在体内实验，标志基因已经被直接和间接转染到韧带和肌腱，体外实验转移cDNA编码的细胞因子如TGF?β1，可促进细胞分裂和胞外基质沉积。新技术显示在原位胶原基质内转染时，韧带细胞持续转基因表达，BMP?12和BMP?13促进间充质干细胞分化，其表象为韧带和肌腱。
3.3 组织工程韧带附丽的基础研究
组织工程韧带替代物坚强固定骨上后才能发挥作用。在骨和新韧带之间形成生物学附丽后，该韧带才能发挥长久的替代功能。了解正常韧带附丽点的基本结构和功能以及软组织和骨之间愈合的基本生物学知识，将有助于研究组织工程韧带的附丽方法，研究出新的韧带坚强附丽技术是十分重要的。 替代韧带可附丽到骨面或骨隧道内。可使用阻滞螺钉[11](金属或可吸收聚合物)将韧带固定在骨隧道内，或者使用缝合、骑缝钉或螺钉和垫片固定在骨隧道外。
目前，对不同方法固定肌腱?骨接合部的基础生物学和生物力学特点还知之甚少。已经清楚固定在骨隧道外的韧带越长，越可能导致韧带?隧道间的移动，原因是韧带所受扭转力过高(橡皮筋效应)，这种运动及运动量对愈合的影响还不清楚。为了应对这种运动，可直接以阻滞螺钉固定。直接以阻滞螺钉固定所造成的力学环境(螺钉挤压)与韧带固定在隧道之外的力学环境(韧带?隧道移动造成剪切)不同。使用生物可吸收螺钉，在聚合物降解过程中，可产生炎性介质，造成局部酸性环境，这些因素极可能影响局部韧带?骨愈合。虽然以螺钉将肌腱挤压到骨上可改善愈合，但是使用阻滞螺钉也可能造成肌腱?隧道的不均匀接触，导致不均匀愈合。其他新固定材料(用于固定ACL)包括通过隧道的横向针，将韧带缠绕后箍紧，以及贴附韧带的聚合物锁定材料，装进套筒后锁进骨内。这些材料要求轻度扩大骨隧道，造成韧带和骨隧道的间隙过小。有关韧带和骨隧道间的间隙小到何种程度会影响愈合以及滑液对韧带?骨界面愈合的影响还不清楚。使用这些材料时，可能发生骨隧道内韧带与皮质骨或松质骨的愈合，至今还没有韧带与隧道内皮质骨还是松质骨愈合研究的报道。
也可将组织工程韧带固定到骨面，以缝合锚、骑缝钉、螺钉和垫片或者综合技术[12]固定到骨面，通常使用缝合锚固定。虽然缝合锚的初始拉力足够大，但是在仅次于最大循环负荷的过程中，可发生部分拉出。这种拉出导致韧带?骨修复位点的间隙形成。还不清楚韧带?骨修复位点间隙较小对愈合的影响以及多大间隙可能影响愈合。不同的韧带修复到骨面技术可能导致韧带和骨间接触面大小不同，接触面对韧带最终的贴附力影响还不清楚。韧带和其下方骨之间压力大小可能会影响愈合程度及最终的贴附力。
3．4 骨和组织工程韧带之间的愈合
骨长入到移植的韧带才能获得新韧带的坚强附丽，骨长入可能受到组织工程韧带的生物化学和结构特性影响。使用的聚合物类型和水解或主动降解的代谢废物，可能影响愈合。残留聚合物的多孔性、孔径大小和孔的几何形状可能影响愈合。使用能支撑和利于骨长入的材料是十分重要的。诱导韧带和其下方骨之间形成纤维软骨区能更有效地降低软组织和硬组织间的应力集中。
允许更早负重，ROM锻炼，更主动地康复，更快地恢复工作或运动[14]。因为肌腱?骨的愈合机制最可能涉及骨长入到肌腱和骨之间的界面，所以骨诱导因子可能参与启动和调节这种骨长入，如骨形态蛋白BMP就有增强骨长入到胶原组织的能力；重组人类BMP?2(recombinant human BMP?2，rhBMP?2)也有增强肌腱在骨隧道的长入能力。组织学分析证实rhBMP?2处理后，骨更早、更充分地长入到肌腱?骨界面，生物力学测试证实贴附力的增加更早。BMP?12可诱导肌腱和骨之间形成正常外形结构的直接附丽。通过对发育中的老鼠胚胎原位杂交研究支持这些发现，证实BMP?12转录mRNA到发育中的肌腱和韧带附丽点。这些数据提示BMP?12在附丽位点发育中发挥主要作用，可有效地增强韧带?骨的愈合。
另一种有利于韧带?骨愈合的细胞因子为TGF?β，外源的rhTGF?β能加速骨长入到狗模型的微孔涂层假体，当以抗TGF抗体阻止TGF?β的活动时，细胞迁移则被抑制，提示TGF?β在成纤维细胞迁移进入肌腱和骨之间界面时发挥重要作用。其他细胞因子如FGF，PDGF、肝细胞生长因子都可能增强韧带?骨的愈合。综合应用生物降解聚合物技术、细胞因子、体外细胞培养、基因转染等组织工程学技术，将会有助于进一步确定韧带修复替代的生物学基本理论，开发出一种新的韧带替代技术。
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