Mg2+对胎鼠皮层神经元NMDA兴奋毒性损伤模型的保护作用
【摘要】 目的 研究Mg2+对神经细胞兴奋性氨基酸NMDA损伤的保护作用。 方法 采用原代培养的大鼠皮层神经细胞模型，给予NMDA直接损伤，加入不同浓度的Mg2+，测定神经细胞损伤MTT变化。结果 Mg2+对兴奋性氨基酸损伤保护作用在1.0~3.0 mmol/L 范围内存在，2.0 mmol/L 效果最好。结论 在临床中尽早使用镁剂，剂量根据脑脊液浓度尽快调整到2.0 mmol/L 保护作用最好。
【关键词】 NMDA受体；镁离子；脑损伤
Protective Effects of Mg2+ on Primary Cortical of Rat Damaged Model by NMDA
Lin Ye?rong, Yu Yi?gang
(1. Department of Obstetrics and Gynecology, PLA 175th Hospital, Zhangzhou 363000, China; 2. Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, Guangzhou 510282, China)
Abstract： Objective To investigate the neuroprotective effects of Mg2+ on the damage by NMDA. Methods Using primary cultured rat cortical neurons, we observed the neuron changes in MTT damaged by NMDA and protective effects of Mg2+. Results The neuroprotective effect of Mg2+ appeared when its strength was between 1.0-3.0 mmol/L and the effect was most effective when the strength was 2.0mmol/L.Conclusion We should use Mg2+ early in clinic, and adjust its strength to 2.0mmol/L in brain cerebral fluid.
Key words： NMDA receptor;Mg2+;brain injury
新生儿窒息是引起新生儿缺氧缺血性脑病的主要原因，具有较高的病死率和神经系统后遗症发生率，对社会人口素质具有严重的影响。其发生主要与围产期窒息有关，一般宫内窒息引起者占50%。因此，如能对胎儿宫内窘迫尽早进行有效的干预，可显著降低其脑损伤发生率及致残率。胎儿的脑代谢最旺盛，其氧耗量占全身氧耗量的一半，所以一旦出现宫内窘迫，脑损伤首当其冲。为解决这一问题我们利用培养的胎鼠皮层神经细胞缺氧缺血所致兴奋性氨基酸NMDA(N?甲基?D?天冬氨酸)损伤模型，探讨硫酸镁对于宫内窘迫所致胎儿大脑缺氧缺血产生的兴奋性氨基酸毒性的保护作用，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1?1 动物、试剂与设备
（1）实验动物 ： 孕龄2周Wistar大鼠，普通级，由南方医科大学动物中心提供。（2）试剂：胎牛血清，马血清，DMEM粉剂购自 Gibco?Brl 公司，阿糖胞苷购自Pharmacia Bio 公司，胰蛋白酶，多聚赖氨酸，谷氨酰胺，N3，NMDA，MK?801购自 sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。（3）设备：二氧化碳细胞培养箱（日本三洋公司），荧光相差显微镜（日本Olympus），DG3022Ａ酶联免疫检测仪(国营华东管厂)
1?2 方法
1?2?1 皮层神经细胞培养[1]
10%水合氯醛2 ml 麻醉大鼠，无菌操作取胚胎，切取浸泡75%乙醇1 min 胎鼠头，解剖出完整鼠脑，预冷解剖液中分离去除软膜、血管，取大脑皮质，漂洗，用眼科剪将其碎成块，0.25%胰蛋白酶37 ℃ 培养箱中消化30 min。接种液洗3次，最后再用接种液1 ml 混悬。将上述混悬液中组织块反复吹打，见浑浊后将上清液移入培养瓶待用。收集含单细胞悬液的上清液4~5 ml 于培养瓶中。细胞记数，接种密度1×106个细胞于96孔培养板中。培养24 h 到细胞贴壁后，换全液用培养液培养4~5 d，观察神经元生长良好，换用阿糖胞苷培养液（4 mg/L）半液培养48~72 h 抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，得到单纯培养的原代神经细胞。隔3~4 d 换全液1次。至8~10 d 后行NMDA损伤保护测定。
1?2?2 NMDA毒性损伤和MgSO4保护作用模型[2]分组
神经细胞培养10 d 后进行实验，分组如下：1组为空白对照组；2组为NMDA损伤+MK-801（250 μmol/L）保护对照组 ；3组为NMDA（250 μmol/L）损伤组；4组为NMDA损伤+Mg 0.5 mmol/L 保护组；5 组为NMDA损伤+Mg 1.0 mmol/L 保护组；6组为NMDA损伤+Mg 1.5 mmol/L 保护组；7组为NMDA损伤+Mg 2.0 mmol/L 保护组；8组为NMDA损伤+Mg 3.0 mmol/L 保护组。每组n=16。
1?2?3 NMDA损伤MTT测定
对照组和初始值组:加入10 μl 的10%的DMSO(用DMEM配制)；实验组：加入倍比稀释的MgSO4各10 μl，终浓度分别为500 mg/L，165 mg/L，55 mg/L，18 mg/L，6 mg/L；孵育1 h；去除实验组和对照组的细胞培养液，加入NMDA(250 mmol/L)200 μl；同时初始值组中加入MTT储存液20 μl，作用4 h；实验组和对照组各孔中加入MTT储存液20 μl，作用4 h，存活的细胞中形成紫蓝色结晶：去除各孔中的液体，加入DMSO 150 μl，溶解紫蓝色结晶； 半小时后，待结晶完全溶解，用酶联仪490 nm波长测定OD值。
1?3 统计学处理
实验设有正常培养神经元组（空白对照），NMDA损伤组（阴性对照），NMDA损伤MK?801保护组（阳性对照），每种保护因素分别与之进行比较并相互比较。应用独立完全随机分组设计，首先进行方差齐性检验(Bartletts test)及正态分布估计。如符合则采用单因素方差分析，One Way ANOVA（F检验）进行分析，如P<0.01，则进一步行各组均数间两两比较（scheffe法）。如方差不齐或偏态分布，则用非参数检验法秩和检验Kruskal Wallis 检验(H检验)，F值和P值，如P<0.01，应用广义线性模型（glm法）进行两两比较。全部数据应用Stata8.0统计软件处理，结果数据以±s表示。
2 结果
2.1 各组资料＞3 s ，各组近似正态分布，见表1。表1 NMDA损伤Mg2+保护作用培养神经细胞分组MTT测量结果（略）
2.2 方差齐性的检验为：χ2=14.897 5，P=0.136>0.01，因此方差是近似齐性，见表2。可以应用参数检验单因素方差分析法进行检验。表2 样本总体组均数方差分析结果 （略）
2.3 组均数比较的方差分析检验
F= 37.98，P< 0.001，总体各组均数不等或不全相等，8组均数的差别有统计学意义，见表3。具体各组均数间的差异需进一步用scheffe法做均数间两两比较。表3 样本总体均数scheffe法组间均数两两比较结果[略]
2.4 结果显示
（1）1，2组间（1空白对照组， 2 NMDA损伤MK?801保护组， 阳性对照组）比较， P= 0.929 >0.05 。 两组间均数差别无统计学意义。（2）1，2组和3组(NMDA损伤组， 阴性对照)比较，P<0.01 。 1，2组和3组间均数差别有显著统计学意义。（3）4，5（0.5 mmol/L 和1.0 mmol/L）组和3组(NMDA损伤组， 阴性对照)比较， P=0.096/0.799 >0.01 。 4，5组和3组间均数差别无统计学意义。 无明显保护作用。（4）6， 7， 8组分别与3组(NMDA损伤组， 阴性对照)比较， P<0.01， 表明与单纯NMDA损伤的结果有显著差异。 具有神经NMDA损伤保护作用。（5）6，7，8组分别与1， 2组（NMDA损伤MK?801保护组， 阳性对照）比较， 其中6，7组P=0.316/0.997/0.262/0.995 >0.05，表明与有MK?801保护效应的结果和无损伤空白组无显著差异。8组P< 0.05，表明8组神经保护作用和空白组和MK?801保护组的效果有显著统计学意义。（6）由对照分组情况我们可以知道：Mg2+在0.5 mmol/L 和1.0 mmol/L 无明显保护作用。当达到1.5~2 mmol/L浓度时具有同MK?801无统计学意义差别的神经兴奋毒性的拮抗保护作用。3 mmol/L 浓度时神经保护作用较MK?801有统计学意义差别。第6期Mg2+对胎鼠皮层神经元NMDA兴奋毒性损伤模型的保护作用 林也容，等
3 讨论
胎儿宫内窘迫是造成新生儿神经系统缺氧缺血损伤最主要的高危因素，随着围产期诊断技术的提高，新生儿病死率逐年下降，而新生儿的脑瘫，癫痫等神经功能缺失症状却反而上升[3]，这为我们提出了新的要求。 宫内窘迫所造成的新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是多因素共同作用的结果，其中兴奋性氨基酸的毒性作用是最重要的始动因素。我们根据宫内窘迫的病理生理变化及Mg2+在神经元脑缺血缺氧所致兴奋性氨基酸损伤的保护作用，直接应用培养大鼠皮层神经元NMDA损伤模型，在最特征性的病理损伤模型中检测Mg2+的神经保护作用。体外培养神经细胞具有可以按实验需要控制神经元生长条件和环境、直接观察细胞形态和生化变化、避免在体内研究时受代谢、血流等多种复杂因素影响的优点。缺氧作为一种病理损害，已经证实能引起下丘脑谷氨酸(GLU)大量释放，并能在一定时间维持[4]。神经细胞周围GLU增高，促进神经元上GLU受体开放，GLU受体中NMDA受体被激活，开放概率、强度显著增加，导致Ca2+内流增加，加速胞内钙聚集[5]。钙作为细胞内参与机能调节的第二信使，在调节细胞功能活动中起到了极其重要的作用，但胞内Ca2+过多会造成：（1）线粒体功能抑制，ATP减少并在原位消耗，细胞能量匮乏；（2）激活磷脂酶A2和C，使膜磷脂大量降解；（3）激活中性蛋白酶，造成蛋白质降解引起细胞损伤和坏死。因此，Ca2+ 超载是导致细胞死亡的最后共同途径[6~7]。作为天然的NMDA受体拮抗剂—Mg2+在脑损伤保护中发挥着关键的作用。脑缺氧缺血损伤患者血清镁水平低下，大量动物实验结果提示高浓度Mg2+对神经细胞有保护作用，其机制包括：（1）Mg2+是NMDA受体电压依赖阻滞剂，是Ca2+内流天然拮抗剂[8]。（2） 舒张脑血管增加缺血局部脑血流[9]。（3） 高浓度Mg2+清除氧自由基。（4）抑制神经元去极化[10]，在本病中Mg2+还可以舒张母体胎盘血管，增加胎儿血供，减少妊高征损害。 通过本实验，我们明确在神经细胞外液Mg2+浓度在1.5~3.0 mmol/L 的范围内Mg2+的保护作用与浓度依赖性正相关，保证脑脊液Mg2+浓度在损伤后维持在此范围的上限，保护作用最显著，0.5 mmol/L时无显著性差异。我们认为对于宫内窘迫患者在早期诊断的基础上，早期应用硫酸镁治疗，控制孕妇血压、增强胎盘供血、舒张胎儿脑血管痉挛、增加脑血流、拮抗兴奋性氨基酸损伤、减少Ca2+细胞内流，能保护神经组织、延迟脑缺氧缺血损伤的发生、减少后遗症。存在的问题是：(1)血脑屏障、胎盘屏障的存在，母血和胎儿脑脊液的Mg2+浓度是否一致；(2)Mg2+的有效浓度和安全范围之间的关系。临床上通过何种途径对母体应用硫酸镁，使之达到有效作用浓度，作为胎儿宫内窘迫脑损害早期治疗的新措施，值得进一步研究。
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