一种重离子辐照诱发细胞内染色体断裂的理论计算方法

【摘要】  目的 建立一种简易、快速的细胞在重离子辐照情况下染色体断裂的理论方法。方法 通过理论计算获得理论值和辐照生物学实验获得实验值相比较。结果 通过理论计算获得的染色体断裂值与实验求得的染色体断裂值吻合良好。结论 重离子在诱发细胞内染色体断裂的高相对生物学效应与其物理特性密切相关。一种非在线辐照模拟计算染色体民裂的方法被予以充分论证，其中影响该模拟过程的三个参数也被详细说明和论证。

【关键词】  重离子 染色体断裂 理论计算

    【Abstract】  Objective  At present study, we reported an easy and quick method on simulating chromosome breaks in cells exposed to heavy charged particles.Methods  The theoretical value of chromosome break was calculated, and validated comparison with experimental value by using premature chromosome condensation technique. Results  A good consistence was found to be appeared between theoretical and experimental value.Conclusion  This suggested that higher relative biological effectiveness of heavy ions was closely correlated with its physical characteristics, also, a safe approach on predicting chromosome breaks in cells exposed to heavy ions at off-line environment come to be considered. Furthermore, three key factors influencing the theoretical simulation was investigated and discussed.

    【Key words】  theoretical simulation;chromosome break; heavy ions

    重离子是目前放射领域内公认的最有效的粒子。德国GSI的和日本的HIMAC已成功地应用重离子治疗了数以百计的肿瘤患者，取得了显著的效果［1］。和普通射线相比，重离子的高治疗效率与其物理特性密切相关，如布拉格峰区的高线性传能密度、低侧向散射等。先前的研究［2～7］表明，细胞在不同的射线辐照下都可以造成染色体断裂，包括染色体不连续、末端错误重排、染色单体环等等。这些潜在的改变都有可能导致细胞的癌变［1，7］。自1995年Gotoh［8］报道了化学诱导的早熟染色体凝集方法以来，该技术被广泛地应用于放射生物学和肿瘤学中染色体损伤的研究。Murakami等［9］用原子力显微镜研究了化学诱导的早熟染色体凝集方法测定染色体损伤的精确度，并把该实验结果与光学显微镜下的研究结果进行了比对研究，发现两者之间没有显著的差异，证明该方法是一种可信的快速而精确的研究染色体损伤的方法。Suzuki等［4～7］, Kawata等［2, 3］用不同线性传能密度的重离子以及X射线对多种细胞进行照射，结果发现：染色体断裂的数量与细胞的吸收剂量呈线性关系，高线性传能密度的射线更易诱发等臂染色单体断裂，而低线性传能密度的射线诱发的染色体断裂以染色单体断裂为主。

    在临床治疗之前，必须制定精确的放射治疗计划，而在这期间不同个体的肿瘤组织的辐射敏感性的检测显得极为重要。研究人员已经发现了多种方法来检测肿瘤细胞的辐射敏感性，比如克隆形成法［10～13］，胞浆阻滞的细胞微核法等。先前的研究结果显示着几种方法都不是很理想的选择，因为克隆形成法虽然精确，但是耗时很长，不能在临床治疗中采用，微核法虽然相对速度较快，但其精确性和特异性都非常低［14，15］。笔者先前的研究［16，17］结果对PCC方法进行了改进，发现辐射诱导的染色体断裂数和细胞存活率之间存在着良好的线性相关性，暗示PCC数量可以作为重离子辐照细胞的辐射生物效应指示计。

    尽管如此，笔者并不认为化学诱导的PCC方法是最理想的研究染色体辐射效应的方法，因为重离子具有非常高的细胞杀伤效应，在线检测对于测试人员和患者都会造成很大的辐射风险。因此本文的主要目的就是建立一种理论计算方法，并以实验结果为标准对其进行验证和校对。

    1  材料与方法

    1.1  12C6+离子辐照后染色体断裂产额的计算模拟  12C6+离子与染色体相互作用诱发染色体断裂是12C6+离子在染色体中发生能量阻止，将其能量传递给染色体的过程。因此染色体断裂的产额与单位细胞内注入的离子数相关，也就是说，与单位面积上的离子通量相关。剂量与离子通量之间的关系可以用下面的公式表示［1］：

    D=1.602×10-9×F×LET×1   ρ材料（1）

    式中D为细胞吸收剂量，F为离子通量，LET为12C6+离子到达细胞时的线性传能密度，ρ材料是被照射靶的密度，细胞是照射的靶，笔者将其密度近似为水的密度，即1g/cm3。那么对应于不同的剂量，实时离子通量可以表示为：

    F=D×1g/cm3   1.602×10-9×LET（2）

    假设每一个12C6+离子可以有效地击中染色体并产生一个断裂，那么在接种?35mm培养皿内的细胞接受照射后平均每细胞内染色体断裂的产额可以表示为：

    N=F×π?2   4   Numbercells（3）

    1.2  细胞培养及辐照  人正常肝细胞系L02（购自CCTCC）用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培养液在37℃，5%CO2的恒温培养箱内培养，培养基内另加入胰岛素0.25U/ml。细胞浓度为5× 106/ml。将充分混匀的2ml L02细胞悬液接种在?35mm的一次性培养皿中，在其发生一次倍增时进行照射。实验照射剂量为0，0.5，1，2，4，6，8Gy，被照射样品处在束流Bragg峰区。实验采用兰州重离子加速器装置产生的单核能为80.55MeV/u的12C6+离子，经13.58mm Lucite（ρ=1.2g/cm3）降能，最后达到细胞表面的总能量为240MeV，在水中射程1.41mm，LET为96.05keV/μm。辐照装置终端引出束流的照射样品直径?=35mm。LET值用Trim92［18］程序计算得到，具体如图1。

    1.3  早熟凝集染色体制备方法和染色体断裂产额实验值  Calyculin-A （购自美国BIOMOL 公司）是一种良好的PCC诱导剂，将其溶于100%的乙醇里制成1mmol/L的储存液。照射前将其加入需照射细胞的培养液内，终浓度为50nmol/L。细胞经照射后在37℃，5%CO2的恒温培养箱内继续培养30min。收集细胞，75mmol/L KCl低渗处理20 min，卡诺氏液固定，最后以少量固定液悬浮细胞，滴片，在热蒸汽上烘干，5% Giemsa染色。

    按照Savage［19］报道的标准，每个剂量点观察不少于40个的G2期细胞，求出这些细胞内染色单体和等点染色单体的平均断裂数，即为该剂量点的染色单体和等点染色单体断裂数，每个等点染色单体断裂被计为两个断裂。

    1.4  统计学处理  数据采用SPSS 8.0进行统计分析，结果以M±SD表示。

    2  结果

    2.1  L02细胞在接受碳离子照射时染色体断裂的计算模拟  假设每一个12C6+离子击中细胞可产生一个染色体断裂，图2是理论计算得到的细胞染色体断裂产额与吸收剂量之间的关系。从图中可以看出，染色体断裂的产额与剂量之间呈线性正相关关系，由算式（3）可知离子通量与剂量之间也是正相关的，所以，染色体断裂的产额正相关于离子通量。

    假设一个碳离子可以产生一个染色体断裂（N=1）

    2.2  碳离子照射L02细胞产生染色体断裂数的实验值  L02细胞在接受不同剂量的12C6+离子照射后，应用早熟染色体凝集技术观测到了细胞内发生了不同程度的染色体断裂（图3）。染色体断裂的形式有染色单体断裂（chromatid break）和等点染色单体断裂（isochromatid break）两种，可以看到，随着剂量的增加，两种形式的染色体断裂产额都相应增加。在每一个剂量点，等点染色单体断裂的产额都显著地高于染色单体断裂。

    2.3  染色体断裂的理论计算值与实验值之间的关系  每一个等点染色单体断裂可以计数为两个染色体断裂，那么实验测得的染色体断裂总产额等于染色单体断裂产额和两倍的等点染色单体断裂产额之和。从图3可以看出，理论计算的染色体断裂产额与实验值与吸收剂量都呈线性正相关关系。假设每一个12C6+离子照射细胞只产生一个染色体断裂（n=1），那么理论值和实验值之间存在很大差距，当每一个12C6+离子照射细胞产生三个染色体断裂（n=3）时，理论值和实验值之间符合良好。

    3  讨论

    3.1  一般性讨论  和普通射线（如X射线）相比，重离子具有特有的生物物理性质，如高相对生物学效应、低氧增比、低修复效应、低侧向散射等，这使得重离子成为目前肿瘤放射治疗手段中最优化的放射束［1］。高的相对生物学效应直接决定了重离子的肿瘤杀伤效率，即用等同于普通射线的剂量可以达到数倍于普通射线的治疗效果。笔者先前的研究也证明加速的碳离子诱发染色体断裂的效率显著高于伽马射线［16］。

    那么重离子的高相对生物学效应是如何产生的呢？是纯粹的物理效应，还是物理效应与生物效应的叠加？细胞内生物酶系统的应激启动不是即时的，如染色体损伤的修复要在细胞损伤后2～12h内进行［20］。

    可见，重离子辐照细胞后产生的原初染色体断裂是完全物理作用的结果，那么和普通射线相比，为什么重离子在致染色体损伤方面具有高的RBE呢？先前的研究资料［2，3］表明，普通射线照射细胞，产生的染色体断裂多为染色单体断裂，而重离子射线由于具有的高的线性传能密度，在单位体积的靶物质内损失的能量远高于普通射线，对染色体而言，单个的重离子轰击可能会产生多个染色体断裂，这是重离子具有高RBE的很重要的因素。在这次实验中，用12C6+照射L02细胞获得的染色体断裂产额，染色体不同断裂形式的比例与上述报道是完全一致的。杨等［21］最近的研究发现，染色体断裂的数量与细胞存活率之间也存在着显著的线性相关性，这意味着化学诱导的早熟染色体凝集技术可以用来预测细胞的辐射敏感性。

    在这次研究中笔者用重离子来诱导正常肝细胞的染色体断裂，实验值与理论值符合良好，提示了理论模拟预测细胞辐射敏感性的可能性。

    3.2  扩展讨论  虽然，离子通量F、细胞吸收剂量D可以准确地监测，显然，上述算式得到的结果只是一个理想状态下的染色体断裂结果，实际上描述了这么一个事实：照射所采用的射线分布是均匀的，即射线的均匀度H=1；在培养皿内的细胞是完全无缝隙地覆盖，即细胞是均匀地铺满了培养皿，没有空隙；染色体是充满了细胞内部空间的，也即是细胞核占据了细胞膜内的绝大部分空间。

    在计划的制定过程中，如果忽略了上述因素，那么细胞辐射敏感性测定结果在临床上应用的可信度就会大大降低，所以，笔者建立计算模型的重点就在于对上述三个影响因素的修正。笔者把这些因素的修正过程分别称为：射线均匀度调制、细胞覆盖率测定和染色体密度近似，表示为：K1，K2，K3，那么现在可以把细胞接受射线照射后染色体发生断裂的产额表示为：

    N’=F×π?2   4   Numbercells×K2K1K3 （4）

    K1是射线LET的修正因子，因为对于任何一种辐射，其LET都不是一个恒定值，必然存在着波动，可以将不同时段的LET实测值求均值来计算K1： 

    K1=?n   1de/dx   n   de′/dx′（5）

    其中， ?n   1de/dx为多次实时测定的LET值之和，n是测定次数，de′/dx′是由监测数据计算得到的该射线的单次LET值。

    K2是细胞覆盖率，生长中的细胞不是完全紧靠在一起的，对于不同的细胞，可以计算出它们平铺时的面积，那么，在细胞辐射敏感性的测定中K2可以表示为：

    K2=Numbercells×Scell   π?2/4（6）

    其中，Numbercells培养皿内待照射细胞的数目，Scell是单个细胞的平铺面积，π?2/4是培养皿的内底面积。

    细胞周期的不同时相，细胞内染色质的凝聚状态和含量各不相同，虽然这种状态对细胞物理密度的影响不是很大，但是其凝聚状态和含量与射线和细胞作用的截面却密切相关，在计算染色体断裂时，G2期细胞染色体形态易于分辨，因此K3可以表示为：

    K3=G2   G0+G1+G2+S+M=G2（7）

    其中，G0，G1，G2，S，M表示细胞在该周期时相的含量。

    总之，如果充分考虑到这些因素，理论计算模拟细胞对于重离子辐射的敏感性将具有非常大的可能和可行性。

    4  结论

    化学诱导的早熟染色体凝集技术可以用来研究和分析重离子辐射引起的染色体断裂，辐射诱发的染色单体/等臂染色单体断裂断裂可被作为预测细胞辐射敏感性的可能性检测指标，理论计算模拟细胞染色体断裂是一种简单、方便而且安全的细胞敏感性预测方法。

【】
  1 Kraft G. Prog Part Nucl Phys, 2000，45 （1）: 473.

2 Kawata T, Gotoh E, Durante M, et al. Int J Radiat Biol, 2000,76 （7）: 929.

3 Kawata T, Durante M, Frusawa Y, et al. Int J Radiat Biol, 2001,77（2）: 165.

4 Suzuki M, Watanabe M, Suzuki K, et al. Int J Radiat Biol, 1992,62（5）: 581.

5 Suzuki M, Watanabe M, Kanai T, et al. Adv Space Res, 1996, 18 （1-2）: 127.

6 Suzuki M, Kase Y, Kanai T, et al. Int J Radiat Biol, 1997, 72 （5）: 497.

7 Suzuki M, Kase Y, Kanai T, et al. Adv Space Res, 1998, 22（4）: 561.

8 Gotoh E, Asakawa Y and Kosaka H. Biomed Res, 1995,16（1）: 63.

9 Murakami M, Minamihisamatsu M, Sato K, et al. J Biochem Biophys Methods 2001,48（3）: 293.

10 Girinsky T, Bernheim A, Lubin R, et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1994,30（4）: 789.

11 West CM, Davidson SE, Burt PA, et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1995,31（4）: 841.

12 West CM, Davidson SE, Roberts SA, et al. Br J Cancer, 1997,76（9）: 1184.

13 Rosenblum ML, Knebel KD, Wheeler K T, et al. In Vitro, 1975,11（5）:264.

14 Eastham AM, Atkinson J and West CM. Int J Radiat Biol, 2001,77（3）: 295.

15 Guo GZ, Sasai K, Oya N, et al. Int J Radiat Biol, 1999,75（7）: 857.

16 Yang JS, Li WJ, Zhou GM, et al. World J Gastroenterol, 2005, 11（26）: 4098.

17 Yang JS, Li WJ, Jin XD, et al. Sci China Ser G, 2006,49（1）: 72.

18 Ziegler JF, Biersack JP and Littmark U. The Stopping and Range of Ions in Solids. Oxford: Pergamon Press, 1985.

19 Savage JR. J Med Genet, 1976,13（2）: 103.

20 Nasonova E, Gudowska E, Ritter S, et al. Int J Radiat Biol, 2001,77（1）: 59.

21 Yang JS, Jing X G, Li W J, et al. Radiat Environ Biophys, 2006,45（4）: 261.