单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4体外抑制白念珠菌芽管形成及粘附作用

               作者：陈新辉，赵明玄，安金刚，李巍，刘玉峰  

【摘要】  　　目的：观察单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外抑制白念珠菌芽管形成及抑制白念珠菌与宿主细胞粘附的作用. 方法：将不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4分别与白念珠菌酵母相悬液在有利于芽管形成的条件下共同孵育，倒置显微镜下计数白念珠菌总数以及白念珠菌芽管数；将不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4与白念珠菌酵母相和人角质形成细胞混悬液、白念珠菌酵母相和人口腔黏膜上皮细胞混悬液、白念珠菌酵母相和胎儿脐静脉内皮细胞混悬液共同孵育，分别计数人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞、胎儿脐静脉内皮细胞上粘附的白念珠菌数. 结果：与对照组比较，不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4均能抑制白念珠菌芽管生成，并且抗体浓度越高，抑制白念珠菌芽管形成的作用越明显；同时单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4能够显著减少白念珠菌与角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞的粘附，其抑制作用与单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4的浓度呈正相关. 结论：单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外能够抑制白念珠菌芽管形成，能够抑制白念珠菌与人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞、胎儿脐静脉内皮细胞的粘附，从而降低白念珠菌的侵袭力，提示天然抗体IgM在机体抗真菌感染的天然免疫中可能具有积极的作用.

【关键词】  白念珠菌；单克隆抗体；免疫，天然

　　Inhibitory effect of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 on germ tube formation and adhesion of Can?dida albicans in vitro

    【Abstract】 AIM: To investigate inhibitory action of a natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 specifically against Candida albicans in vitro. METHODS: The different concentrations of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 were incubated with Candida albicans yeast phase suspension on condition that profited germ tube formation of Candida albicans to observe the action of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 to Candida albicans germ tube formation.And the different concentrations of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 were incubated with the mixed suspenions of Candida albicans yeast phase with malpighian cells, human buccal epithelial cells, endothelial cells of fetal umbilical vein, respectively, to observe the action of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 to the adhesion of Candida albicans to malpighian cells, human buccal epithelial cells and endothelial cells of fetal umbilical vein. RESULTS: It was found that the different concentrations of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 could inhibit Candida albicans germ tube formation and adhesion of Candida albicans to malpighian cells, human buccal epithelial cells and endothelial cells of fetal umbilical vein.Its inhibitory action was positively related to the level of natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4. CONCLUSION: Natural monoclonal anti?keratin antibody IgM 3B4 can inhibit the adhesion of Candida albicans to the malpighian cells, human buccal epithelial cells and endothelial cells of fetal umbilical vein, and decrease the invasion of Candida albicans due to its inhibitory action on the formation of Candida albicans germ tube,which indicates that natural antibody IgM plays a role in the natural immunity against yeast infection.

    【Keywords】 Candida albicans； monoclonal antibody；immunity，natural

　　0引言

    随着抗生素滥用、肿瘤化疗患者增多以及免疫缺陷人群的不断扩大，真菌感染的临床意义越来越重要，但是抗真菌感染的免疫应答机制尚未完全阐明. 近年来，人们逐渐认识到体液免疫在抗真菌感染中也起着重要作用［1］，而天然体液免疫又构成了机体抵御外来感染的第一道防线，天然抗体的作用逐渐引起人们的重视，同时值得注意的是无论是临床还是动物实验均未发现口腔念珠菌感染有系统扩散的现象从而提示先天免疫系统在全身抗念珠菌感染的重要地位，其中天然抗体必然起着关键的作用. 本课题组在前期工作中成功筛选到了3株(分别命名为2H8，3B4，4G2)稳定分泌天然抗角蛋白抗体的杂交瘤细胞，并发现其中一株分泌的IgM 3B4抗体具有广泛的多反应性，可以识别包括真菌、细菌、病毒成分在内的多种抗原［2］，并且本课题组近期的研究发现正常 C57BL /6小鼠机体内存在与白念珠菌结合的以IgM型为主的天然抗体［3］. 我们拟通过观察IgM 3B4抗体在体外抑制白念珠菌芽管生成以及抑制白念珠菌与角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞之间粘附的情况，为进一步研究天然IgM 抗体在抗真菌感染中的作用机制提供实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料mAb IgM 3B4，mAb IgM 4G2杂交瘤细胞株由本所建立［4］；白念珠菌国际标准菌株ATCC?90028（第四军医大学西京检验科）；IgM同型对照(TEPC，Sigma公司)；角质形成细胞无血清培养基（KC?SFM，Gibico公司）；RPMI 1640干粉培养基（Gibico公司）；人角质形成细胞株HaCaT (南京医科大学第一附属医院皮肤科惠赠)；人口腔黏膜上皮细胞(健康志愿者提供)；脐静脉内皮细胞细胞株ECV?304(第四军医大学唐都医院核医学科惠赠)；6～8 wk龄SPF级BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心）；SDA平板配方(麦芽糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，调pH至7.0，118℃灭菌15 min，倾注平板，无菌试验后备用)；SDA液体培养基配方(麦芽糖40 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 L，调pH至7.0，118℃灭菌15 min，无菌试验后备用)；GSB液体培养基配方［葡萄糖10 g，NaH2PO4 3.5 g，(NH4)2SO4 2.5 g，MgSO4.7H2O 2.5 g，CaCl2 2.1 g，D?Biotin 40 mg，氯霉素40 mg，蒸馏水1 L，调pH至7.0，118℃灭菌15 min，无菌试验后备用］；其它试剂为本所常规贮存.

    1.2方法

    1.2.1IgM 3B4抗体抑制白念珠菌芽管形成实验［5］冻存条件下白念珠菌接种于SDA平板，25℃，24 h，然后转种于SDA液体培养基，37℃，24 h，再转种于GSB液体培养基，测A490 nm≤0.01， 25℃，200 r/min，48 h后收获白念珠菌酵母相. 取白念珠菌酵母相，用不完全1640培养液（pH 7.0，不含血清）调整白念珠菌酵母相浓度至5×108个/L. 将白念珠菌酵母相悬液分成5组，每组1 mL，实验组加入IgM 3B4抗体，抗体最终浓度分别为50，20，5 mg/L；对照组分为IgM同型对照(TEPC)和IgM 4G2抗体，最终浓度为50 mg/L；空白对照组加入无菌生理盐水. 37℃，微震荡孵育1.5，3 h后分别取样，对每组样品在光学倒置显微镜下(×400)计数10个视野的全部白念珠菌以及长出芽管的白念珠菌，各取其平均值，芽管生成率. 芽管生成率=（带芽管的白念珠菌数目/白念珠菌总数）×100％.

    1.2.2IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与相关细胞粘附取角质形成细胞无血清培养基培养扩增的HaCaT细胞经无菌生理盐水洗涤3次，调整细胞密度至1×108个/L，每组500 μL. 实验组加入IgM 3B4抗体，抗体最终浓度分别为50，20，5 mg/L；对照组分为IgM同型对照(TEPC)和IgM 4G2抗体，最终浓度为50 mg/L；空白对照组加入无菌生理盐水. 白念珠菌酵母相浓度调整为5×1010个/L，取400 μL与上述各组混匀， 37℃，微震荡孵育3 h后各组分别取样，经生理盐水洗涤3次后涂片，行革兰氏染色后对每组样品在光学显微镜(×400)下计数100个角质形成细胞上粘附的白念珠菌数，取平均值. IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与人口腔黏膜上皮细胞、脐静脉内皮细胞粘附的实验比照IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与人角质形成细胞粘附的实验进行.

    统计学处理：计量数据用x±s表示， IgM 3B4抗体组与各对照组之间比较采用SPSS 13.0统计软件行方差分析；IgM 3B4抗体组之间均数的两两比较行SNK?q检验，具有统计学意义取双侧P<0.05.

    2结果

    2.1IgM 3B4抗体对白念珠菌芽管形成的抑制作用IgM 3B4抗体各浓度组抑制白念珠菌芽管生成率与空白对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05，表1）. IgM 3B4抗体各组与IgM同型对照(TEPC)以及IgM 4G2抗体组相比也具有显著差异(P<0.05)，而IgM同型对照组(TEPC), IgM 4G2抗体组与空白对照组间差异没有统计学意义. 3 h的芽管形成率与1.5 h的基本一致.表1白念珠菌芽管生成率

    2.2IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与相关细胞粘附的实验IgM 3B4抗体浓度为50，20  mg/L时，白念珠菌粘附于单个人角质形成细胞的数目均少于IgM同型对照组(TEPC), IgM 4G2抗体组、空白对照组， 与各对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05， 表2)， 当IgM 3B4抗体浓度为5 mg/L时与各对照组比较差异没有统计学意义； 而IgM 3B4抗体浓度为50， 20， 5 mg/L的各组之间差异则具有统计学意义(P<0.05)；其余各组与空白对照组间差异没有统计学意义. IgM 3B4抗体对白念珠菌与人口腔黏膜上皮细胞粘附的抑制作用大体上和IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与人角质形成细胞粘附的情况相同. IgM 3B4抗体各浓度组与IgM同型对照组(TEPC), IgM 4G2抗体组、空白对照组比较，IgM 3B4抗体各浓度组胎儿脐静脉内皮细胞上粘附的白念珠菌数均明显少于各对照组，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)；IgM 3B4抗体各浓度组之间差异亦具有统计学意义(P<0.05)；而IgM同型对照组(TEPC), IgM 4G2抗体组与空白对照组间差异则没有统计学意义.表2IgM 3B4抗体作用后白念珠菌粘附到相关细胞上的数目比较

    3讨论

    白念珠菌的致病因素包括对宿主细胞的粘附、芽管形成、抗吞噬作用、分泌多种酶类（水解酶、脂酶、蛋白酶）等，其粘附到宿主细胞表面是其致病的首要条件［6］. 因此，如能抑制白念珠菌的粘附，将会有效地抑制其致病活性. 我们在研究天然抗角蛋白抗体的过程中，发现IgM 3B4抗体具有多反应性，同时免疫荧光染色证实IgM 3B4 抗体识别白念珠菌芽管胞壁外膜抗原,并且已经明确IgM 3B4抗体识别的是其芽管胞壁上的一类糖蛋白［7］，从而提示IgM 3B4抗体可能对白念珠菌的芽管形成和粘附具有一定的作用，进而研究IgM 3B4抗体对白念珠菌的作用并选择了其入侵途径首先接触的细胞研究IgM 3B4抗体对其粘附作用的影响.

    我们将IgM 3B4抗体运用于体外抑制白念珠菌芽管形成及其与宿主细胞粘附作用的实验研究，结果表明IgM 3B4抗体能够显著抑制白念珠菌芽管形成，亦能够抑制白念珠菌与上皮细胞、内皮细胞之间的粘附. 尽管对上皮细胞（人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞），IgM 3B4抗体在较低浓度时几乎没有抑制作用，但当IgM 3B4抗体升高到一定浓度时，粘附于其上的白念珠菌数目亦相应减少. IgM 3B4抗体抑制白念珠菌与上皮细胞、内皮细胞之间的粘附的结果表明抗体的抑制作用与抗体的浓度之间存在一定正相关关系. 白念珠菌由酵母相转变为菌丝相的过程由其体内基因转换系统控制，菌相转换时，伴随有菌体胞壁上蛋白及其他成分在质和量上的改变，针对IgM 3B4抗体对其粘附作用的抑制，我们推测是IgM 3B4抗体与其胞壁表面的相应配体结合后，可能通过信号转导途径，影响了其粘附素或者凝集素基因的表达而降低白念珠菌的粘附力，但具体机制还有待进一步研究. 在本实验中，考虑到IgM 3B4抗体可能对上皮细胞的增殖会具有影响，为了观察是由于该抗体影响了上皮细胞的增殖从而影响了白念珠菌对上皮细胞的粘附还是由于该抗体抑制了白念珠菌芽管形成从而影响了对上皮细胞的粘附，我们设置了IgM 4G2抗体组作为对照，IgM 4G2抗体与IgM 3B4抗体同属于单克隆天然抗角蛋白抗体，但其不具有多反应性，也不能抑制白念珠菌芽管形成. 实验中通过与IgM 4G2抗体比较我们排除了IgM 3B4抗体对上皮细胞增殖影响的作用，真实的反映了IgM 3B4抗体对白念珠菌粘附作用的抑制.

    总之，我们初步认识到单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外能够与白念珠菌结合并抑制其芽管形成，通过抑制白念珠菌芽管形成进而抑制白念珠菌与上皮细胞、内皮细胞的粘附，具有一定抗白念珠菌毒力的作用，但天然IgM抗体确切的保护性机制还不太清楚，可能与抑制芽管形成、抑制粘附、中和与毒力相关的酶以及直接杀伤白念珠菌等作用有关.

【】
  ［1］ Polonelli L, Magliani W, Conti S, et al. Therapeutic activity of an engineered synthetic killer antiidiotypic antibody fragment against experimental mucosal and systemic candidiasis［J］. Infect Immunol,2003,77(11):6205-6212.

［2］ Fu M, Fan PS, Li W, et al. Identification of poly?reactive natural IgM antibody that recognizes late apoptotic cells and promotes phagocytosis of the cells［J］. Apoptosis, 2007,12(2):355-362.

［3］ 田蓉, 苏雯静, 张欣，等. 抗白念珠菌天然抗体的检测与分析［J］.细胞与分子免疫学杂志，2007,23(4):367-368.

［4］ 付萌，李巍，王刚，等.天然属性的抗角蛋白单克隆IgM抗体的制备［J］.中华皮肤科杂志,2005,38(4):208-210.

［5］ Moragues MD, Omaetxebarria MJ, Elguezabal N, et al. A monoclonal antibody directed against a Candida albicans cell wall mannoprotein exerts three anti?C. albicans activities［J］. Infect Immun,2003,71(9):5273-5279.

［6］ Cutler JE. Putative virulence factors of Candida albicans［J］. Annu Rev Microbiol, 1991, 45:187-218.

［7］ Li W, Fu M, An JG, et al. Host defence against C. albicans infections in IgH transgenic mice with V(H) derived from a natural anti?keratin antibody［J］. Cell Microbiol,2007,9(2):306-315.