登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析
作者：贡树基 周浩 陈丽丹 梁冰锋
【摘要】 目的 扩增登革病毒2型新几内亚株（NGC）E基因，并进行B细胞抗原表位分析。方法 根据登革2型病毒NGC株E基因序列设计引物，采用RT?PCR技术扩增NGC株E基因并克隆至pGEM?T载体，转化大肠杆菌DH5α后测序。按Kyte?Doolittle方案、Jameson?Wolf方案和Emini方案预测B细胞抗原表位。结果 通过RT?PCR方法，获得了登革2型病毒NGC株E基因，并对登革2型病毒NGC株E基因进行B细胞抗原表位预测。结论 通过RT?PCR方法，获得了登革2型病毒NGC株E基因，为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。
【关键词】 登革病毒； E基因； B细胞抗原表位
【Abstract】 Objective To amplify the E gene of dengue 2 virus NGC and analyze the B cell epitope of E protein. Methods According to the sequences of NGC E gene,a pair of primers were designed for the amplification of the E gene fragment from the isolate of dengue 2 virus NGC with RT?PCR. The amplified E fragment was cloned into vetor pGEM?T and sequenced. The B cell epitope of E protein of dengue 2 virus NGC was analyzed by Kyte?Doolittle method、Jameson?Wolf method and Emini method. Results The 1 485 bp length E gene of dengue 2 virus was amplified successfully by the RT?PCR. The B cell epitope of dengue 2 virus was predicted. Conclusion The E gene of dengue 2 virus was successfully amplified by the RT?PCR．And it will be advantageous for monoclonal antibody and vaccine preparation of E gene of dengue 2 virus.
【Key words】 Dengue virus； E gene； B cell epitope
登革病毒（dengue virus，DEN）属黄病毒科黄病毒属，基因组为单股正链RNA，全长约11 kb，包括5'和3'非编码区及一个开放阅读框。DEN共有4个血清型，均可引起登革热（DF）、登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS），通常登革2型病毒（DEN2）的感染较其他血清型更为严重［1?4］。
大量研究表明，E蛋白作为登革病毒重要的抗原蛋白，它不仅是登革病毒主要的毒力蛋白，而且还带有型特异、属特异抗原决定簇。E蛋白存在诱导中和抗体及血凝作用有关的抗体表位，它能诱导宿主产生保护性的中和抗体，又能诱导产生血凝抑制抗体，可引起宿主保护性免疫反应，此外还与DHF和DSS的致病机制有关。同时，E蛋白在毒粒侵染细胞过程中起重要作用，E蛋白上可能具有某些宿主细胞表面受体结合的配体。因此，获得高纯度的E蛋白为制备登革病毒高效、特异的单克隆抗体和研究宿主细胞上登革病毒受体有重要意义，还为进一步探讨DHF、DSS的致病机制提供坚实的基础。本研究通过RT?PCR方法，构建了登革2型病毒新几内亚株(NGC)E基因的克隆载体，并对其E蛋白进行B细胞抗原表位分析，为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 病毒RNA制备 登革2型病毒NGC株经鼠脑内接种传代后，取1/2发病鼠脑，用Trizol（美国Invitrogen公司）提取总RNA，于-70℃保存备用。
1.2 PCR引物设计 根据登革2型病毒NGC株基因组全序列（GenBank Access Number：AF 038403）用Primer软件设计引物，PCR引物序列及位置：P1引物：5'?atgcgttgcataggaatatcaaata?3'，位于其基因组的937处；P2引物：5'?ggcctgcaccataactcccaaatac?3'，位于其基因组的2 422处。扩增片段长度为1 485 bp。
1.3 反转录合成cDNA 取15 μl总RNA，加入1 μl 10 μmol／L反向引物，95℃作用3 min，随后置冰浴中1 min，再加入5 μl 5×缓冲液、1 μl 二硫代苏糖醇（DTT）、1 μl RNA酶抑制剂、2 μl SuperScript llI逆转录酶（美国Invitrogen公司）、1 μl 10 μmol／L dNTPs，最后加焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水至总体积30 μl，55℃保温3 h进行反转录，反应完毕，70℃灭活15 min。逆转录产物中加入1 μl 重组RNase H，37℃ 温育20 min，去除cDNA中混合的RNA。
1.4 PCR反应条件 利用La Taq酶（日本TaKaRa公司）进行PCR反应，最终采用30 μl反应体系：2 μl模板DNA（250 ng／μl）、3 μl 10×缓冲液（Mg2＋ 25 mmol／L）、0.5 μl dNTP（50 mmol／L）、1 μl La Taq酶（5 U／μl）、上下游引物各1 μl（10 μmol／L）、水21.5 μl。反应条件：94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 2 min，扩增30个循环；最后72℃ 延伸7 min。PCR产物使用0.7％琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段大小。
1.5 PCR 产物的纯化 使用DNA 纯化试剂盒（日本TaKaRa公司）纯化DEN2 E基因预期长度的PCR产物。-20℃保存备用。
1.6 PCR产物与pGEM?T载体连接 将回收产物与pGEM?T载体（Promega公司）连接，4℃放置12 h。将重组载体转化DH5α感受态细胞，于含氨苄青霉素的固体LB培养基37℃培养16 h，利用X?Gal和IPTG筛选阳性克隆。获得的阳性克隆菌分别经PCR和双酶切初步鉴定，送TaKaRa公司测序。
1.7 序列分析 采用DNAman软件对测序结果与登革2型病毒NGC株E基因核苷酸序列进行同源性比较。运用DNAstar软件分别预测E蛋白的亲水性肽段、表面可能性肽段和抗原指数的肽段。
2 结果
2.1 RT?PCR扩增结果 以提取的总RNA为模板，应用RT?PCR方法扩增获得约1 485 bp DNA片段，与预期大小相符，见图1。
图1 RT?PCR扩增结果（略）
M：DNA Marker wide 15 000 1：登革2型病毒E基因PCR扩增产物
2.2 E基因克隆 将上述PCR产物纯化回收后，与pGEM?T载体连接，转化DH5α感受态细胞，利用蓝白斑菌落筛选阳性重组克隆，对阳性质粒（pGEM?T?E）进行单酶切及双酶切初步鉴定，见图2。
图2 E基因克隆及鉴定（略）
M：DNA Marker DL 15 000 1：E基因连接pGEM?T载体 2：NotI单酶切pGEM?T?E3：NotI和SacII双酶切pGEM?T?E
2.3 序列测定 测序结果表明，所获得片段与NGC株E基因核苷酸序列同源性达到100％，证明我们克隆出的是NGC株E基因。
2.4 B细胞抗原表位分析 运用Kyte?Doolittle方案、Emini方案和Jameson?Wolf方案分别预测E蛋白的亲水性肽段、表面可能性肽段和抗原指数的肽段，3个预测指数形成的共同区域均分别位于病毒E蛋白N?端第34?41、48?56、65?80、85?89、125?128、133?136、144?148、154?161、241?249、289?293、326?330、343?346、361?364和470?474肽段内，见图3。
图3 登革2型病毒E基因B细胞抗原表位分析（略）
3 讨论
目前，关于病毒的检测一般包括病毒分离、核酸杂交法、聚合酶链反应（PCR）、免疫荧光以及ELISA试验等方法［5，6］。其中，病毒分离及核酸杂交法其操作比较繁琐，对仪器要求较高，而且周期都较长、很难在实践中得到应用；PCR方法简便、快速，但假阳性、假阴性率较高，且实际操作中存在交叉污染的问题，对人员要求较高，目前临床上一般不主张采用；而免疫荧光、ELISA 等免疫学方法具有操作简便、对仪器要求低的优点，在临床上已得到广泛应用。但对登革病毒，目前国内仍未建立特异性强、稳定性高的特异性检测抗体，目前其检测的假阳性率普遍较高，大大限制了它们的应用，随着分子生物学技术的，蛋白体外表达、纯化技术日益成熟，为疫苗的研制及蛋白特性分析提供了新的有力手段。与常规抗原相比，基因工程抗原具有纯度高、成分单一、易于大规模生产等优势，为登革病毒的快速诊断提供了新的手段。在本研究中，我们成功构建出了登革2型病毒E基因的克隆载体，进一步的酶切及测序结果也说明载体构建正确，并对登革2型病毒E蛋白进行B细胞抗原表位分析，为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。
【】
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