黄褐毛忍冬总皂苷对卵清蛋白致敏小鼠的抗过敏作用

【摘要】  目的： 观察黄褐毛忍冬总皂苷（Ful）对卵清蛋白（OVA）致敏小鼠的抗过敏作用，为临床用于食物过敏提供药依据. 方法： 建立BALB/c小鼠食物过敏模型，设过敏反应组（Se），Ful高（H）、中（M）、低（L）浓度组及生理盐水对照组（NS）. ELISA测定血清中OVA特异性IgE水平、小肠黏液中总IgA及OVA特异性IgA水平；甲苯胺蓝染色观察空肠及肠系膜肥大细胞，HE染色观察空肠形态；足垫肿胀实验检测迟发型超敏反应. 结果： OVA隔日激发3~4次后，Se，L，M组均有3/4以上小鼠出现急性腹泻. 高浓度Ful可抑制过敏小鼠腹泻发生，减轻肥大细胞聚集和脱颗粒，降低OVA特异性IgE水平，缓解OVA介导的足垫肿胀反应，减轻小肠绒毛炎症. 结论： 高浓度Ful可同时缓解食物过敏小鼠IgE介导的及细胞介导的超敏反应.

【关键词】  黄褐毛忍冬总皂苷 食物过敏 卵清蛋白

　0引言

　　食物过敏是儿童期常见的变态反应性疾病，患病率逐年上升，严重影响了儿童尤其是婴幼儿的生活质量. 目前，对食物过敏治疗的研究包括免疫疗法、益生菌疗法及基因疗法［1］等. 此外，传统中药以其价廉、有效、副作用小等优点，作为抗过敏治疗的补充和替代亦受到重视. 我们前期研究已证实，单味金银花（黄褐毛忍冬）水提物对卵清蛋白（ovalbulmin, OVA）导致的速发型和迟发型变态反应均有缓解作用［2］，现进一步选用黄褐毛忍冬总皂苷（fulvotomentoside, Ful）作用于OVA致敏小鼠，观察其抗过敏作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料OVA（Sigma, USA）；氢氧化铝凝胶（Sigma, USA）；大鼠抗小鼠IgA（Biolegend, USA）；辣根过氧化酶（HRP）标记的大鼠抗小鼠IgE及羊抗小鼠IgA（Southern Biotechnology Associates, USA）.

　　1.2方法

　　1.2.1黄褐毛忍冬总皂苷分离提取药材来源于贵州黔西南州种植基地，部位为黄褐毛忍冬干燥花蕾. 系贵州中医药研究院以大孔树脂工艺提取，样品中Ful含量为66.11%.

　　1.2.2建立动物模型及分组重庆医科大学实验动物中心提供的BALB/c小鼠连续传两代，以第3代雌鼠（6 wk龄）作为实验对象. 40只小鼠随机分为5组，每组8只. 取其中4组建立食物过敏模型，分为过敏反应组（Sensitization group, Se）以及Ful高（200 mg/kg, H）、中（100 mg/kg, M）、低（50 mg/kg, L）浓度组；另设生理盐水对照组（NS）. ①基础致敏和强化致敏：Se及H，M，L组第1日用含10 μg OVA（V级）及1 mg氢氧化铝凝胶的生理盐水0.5 mL腹腔注射腹腔注射.进行基础致敏，第15日用只含10 μg OVA（V级）的生理盐水0.5 mL腹腔注射.强化致敏，NS组腹腔注射等量生理盐水. ②激发肠道过敏反应：第20日起以OVA（Ⅱ级）生理盐水溶液0.4 mL（OVA浓度250 g/L）对Se及H，M，L组进行隔日灌胃激发直至第42日，NS组同时以等量生理盐水灌胃. ③给药：第20日起给H，M，L组依不同的体质量皮下注射相应浓度的Ful，0.01 mL/g，1次/d×22d. Se及NS组皮下注射等量生理盐水.

　　1.2.3血清OVA特异性IgE水平检测采用ELISA法，以每孔100 μL OVA（浓度10 mg/L）包板，血清样品按原浓度加样. 结合反应时HRP标记的大鼠抗小鼠IgE二抗稀释浓度为1∶1000， TMB显色后终止反应，全自动酶标仪测定A450 nm值.

　　1.2.4小肠黏液总IgA及OVA特异性IgA水平检测肠黏液采集和处理参照［3］，采用ELISA法. OVA特异性IgA检测时OVA包被浓度为10 mg/L，总IgA检测时大鼠抗小鼠IgA按1∶1000稀释后包被，小肠黏液均按1∶25稀释，结合反应中二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgA，以1∶1000稀释.

　　1.2.5形态学观察HE染色观察空肠形态；甲苯胺蓝染色观察空肠及肠系膜肥大细胞. 随机连续计数空肠10个高倍视野内肥大细胞数，取平均值代表其密度. 累计肠系膜10个高倍视野内肥大细胞总数及脱颗粒肥大细胞数，完整肥大细胞百分率. 完整肥大细胞百分率＝［（肥大细胞总数－脱颗粒肥大细胞数）/肥大细胞总数］×100%.

　　1.2.6迟发型超敏反应（DTH）检测第40日时进行足垫肿胀实验. 用游标卡尺测量小鼠后足垫厚度，之后足垫注射0.05 mL OVA（浓度2 g/L）溶液. 48 h后再次测量同一部位，以两次测量差值作为评价OVA特异性DTH的指标.

　　统计学处理：采用SPSS11.0统计软件. 各组数据进行方差齐性检验提示方差齐同，结果以x±s表示，用SNK法（q检验）在各组间做两两比较，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1腹泻发生情况经OVA隔日激发3~4次后，Se，L，M组均有3/4以上小鼠在灌服OVA 15~30 min内排出糊状或水样便，之后上述小鼠在每次激发后均会出现持续1 h左右的急性腹泻过程，其余时段则为正常大便. H组发生腹泻的小鼠少于1/4，NS组无1例发生腹泻.

　　2.2血清OVA特异性IgE水平Se，L，M组血清OVA特异性IgE水平高于H与NS组. H组OVA特异性IgE下降，与NS组无统计学差异（P>0.05，表1）.

　　2.3小肠黏液总IgA及OVA特异性IgA水平小肠黏液总IgA及OVA特异性IgA水平各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05，表1）.

　　表1各组血清卵清蛋白（OVA）特异性IgE、小肠黏液总IgA和OVA特异性IgA水平（略）

　　aP<0.05 vs Se，L，M组. NS：生理盐水组； H：Ful高浓度组； M：Ful中浓度组； L：Ful低浓度组； Se：过敏反应组.

　　2.4形态学观察空肠HE染色示Se组绒毛上皮细胞局灶性坏死、脱落，固有层中淋巴细胞、浆细胞等炎症细胞浸润. M，L组炎症较Se组无明显改善. H组炎症改善，小肠上皮脱落及坏死减少，炎症细胞浸润减轻（图1）. 空肠甲苯胺蓝染色示Se和L，M组出现肥大细胞聚集，且多数胞膜破裂，并向外排出颗粒. H组肥大细胞聚集及脱颗粒现象均缓解（表2）.肠系膜甲苯胺蓝染色示肥大细胞数均较空肠中为多. Se组见多数肥大细胞脱颗粒，H组肥大细胞脱颗粒受到抑制，M，L组抑制作用不明显（表2，图2）.

　　2.5迟发型超敏反应Se，L，M组诱导出较强的DTH反应；H组DTH反应较Se，L，M组减弱（表2）.

　　3讨论

　　鸡蛋过敏是儿童食物过敏反应的常见原因，我们前期研究建立了OVA致敏小鼠模型，该模型具有食物过敏反应的两大特征：血清抗原特异性IgE增高及小肠组织胺释放. 但OVA激发并未诱导出腹泻等临床常见症状，本文在原有基础上结合国外［4］对该模型进行改良：①增加OVA激发次数，将造模周期由30日延长至42日；②加大OVA激发剂量，改为每只小鼠每次100 mg OVA隔日灌胃. 经上述处理，致敏小鼠在激发3~4次后出现腹泻症状，使得本模型能更好地模拟食物过敏的临床状态，且给药后症状改善与否亦有助于判断药物疗效.

　　A：生理盐水组； B：Ful高浓度组； C：Ful中浓度组； D：Ful低浓度组； E：过敏反应组.

　　图1各组小鼠小肠绒毛形态HE染色 ×400（略）

　　表2各组空肠肥大细胞密度、肠系膜肥大细胞完整率及足垫厚度差值（略）

　　aP<0.05 vs Se，L，M组. NS：生理盐水组； H：Ful高浓度组； M：Ful中浓度组； L：Ful低浓度组； Se：过敏反应组.

　　我们前期已证实金银花水提物具有较好抗过敏原诱导的肠道炎症的作用，但其中何种成分发挥这一作用尚不清楚. 金银花药用主要成分包括皂苷类、黄酮类、有机酸类等［5］，其中皂苷类成分具有抗炎抗过敏作用. 分离自金银花的忍冬苦苷C对巴豆油所致小鼠耳肿胀具有抗炎活性［6］. 从黄褐毛忍冬中提取的总皂苷对脚叉菜胶所致大鼠足肿胀有明显抑制作用，并可抑制多种致炎剂引起的毛细血管通透性增加［7］，因此本实验选用Ful进行研究. Ful口服无效，其口服失活可能是因给药过程中被胃酸水解所致［8］. 而Ful静脉注射可能引起溶血，皮下注射则有较好效果，故本研究选用此途径. 但在给药过程中发现Ful皮下注射可引起局部皮下硬结或淤血，因而制备肠溶型制剂通过口服给药应为今后改进的方向.

　　A：生理盐水组； B：过敏反应组.

　　图2生理盐水组及过敏反应组肠系膜中肥大细胞甲苯胺蓝 ×1000（略）

　　食物过敏主要以Ⅰ型变态反应为主，致敏原进入体内后通过IgE抗体与肥大细胞上的相应受体结合，致使肥大细胞脱颗粒并释放炎性介质，从而介导小肠炎症的发生. 抑制其中任何一个环节均可减轻过敏症状. Brandt等［4］认为肠道炎症相关性口服过敏原诱导的腹泻是IgE、肥大细胞、5?羟色胺和血小板活化因子依赖性的. 本研究证实高浓度Ful可降低OVA特异性IgE水平，减轻肠道及肠系膜中肥大细胞的聚集和脱颗粒，从而有效缓解OVA激发所致的腹泻症状，而中浓度及低浓度组则无明显作用.

　　在速发型变态反应中，肠道分泌型IgA是一个较为重要的免疫保护成分，对食物等抗原物质具有封闭作用；或使抗原物质局限于黏膜表面，难以进入机体内部，使超敏反应不能发生. 本研究发现Se组与NS组肠道黏液IgA含量无差别，Ful亦对总IgA和抗原特异性IgA无明显影响，提示Ful并非通过改变肠道IgA含量而发挥抗过敏作用.

　　小肠组织形态观察及足垫肿胀实验结果证实，本动物模型也同时存在着细胞介导的超敏反应. 高浓度Ful可在一定程度上改善小肠炎症，部分缓解食物过敏原导致的DTH反应.

　　综上所述，本研究表明一定浓度的Ful对OVA导致的速发型和迟发型变态反应均有缓解作用，其作用机制有待于进一步深入研究.

【文献】
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　　［5］ 武晓红, 田智勇, 王焕. 金银花的研究新进展［J］. 时珍国医国药,2005,16(12):1303-1304.

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　　［7］ 刘杰, 夏俐, 陈秀芬, 等. 黄褐毛忍冬总皂甙的抗炎作用［J］. 药报,1988,9(5):395-397.

　　［8］ 杜江, 丁宁, 贾宪生. 黄褐毛忍冬总皂苷肠溶型固体分散体的制备及释放度考察［J］. 中国中药杂志,2002,27(7):513-514.