SHP1表达与慢性粒细胞白血病进展的初步研究

【摘要】  目的： 探讨SHP1表达与CML急变的关系；构建SHP1真核表达载体. 方法： 应用RT?PCR比较慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平；SHP1真核表达载体pcDNA3.0?SHP1的测序，检测其mRNA和蛋白表达. 结果： 急变期患者SHP1转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异；pcDNA3.0?SHP1转染K562细胞，可表达SHP1 mRNA和蛋白. 结论： SHP1的表达下调可能与CML由慢性期朝加速/急变期演化过程有关；成功构建了SHP1真核表达载体pcDNA3.0?SHP1.

【关键词】  白血病 髓样 进展期 SHP1

    0引言

    慢性髓系白血病（chronic myeloid leukaemia, CML）是一种累及造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，近90％的患者肿瘤细胞中可以检测到Bcr?Abl融合基因，该基因催化自身和一系列底物的酪氨酸残基（tyrosine residue，Tyr）发生过度磷酸化，导致多个信号传导通路的异常激活，最终导致CML的发生. SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）家族的重要成员，能够通过催化受体Tyr残基“去磷酸化”抑制信号传导. 我们应用RT?PCR比较了慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平，并克隆SHP1全长cDNA序列，构建真核表达载体，以用于进一步研究SHP1在CML发病及进展中的潜在作用.

    1对象和方法

    1.1对象CML患者11（男6，女5）例，中位年龄28岁. 患者骨髓单个核细胞经按G显带制备染色体及核型分析和/或间期荧光原位杂交检测发现有Ph染色体和或/Bcr?Abl融合基因（表1），临床诊断慢性期7例，急性期4例. 正常对照选择骨髓未受浸润的恶性淋巴瘤患者3例. 均抽取无菌肝素抗凝骨髓3～5 mL，Ficoll分离单个核细胞，预冷PBS（pH=7.4）洗涤细胞2遍备用. HEL细胞和K562细胞购自上海细胞生物研究所；RPMI1640培养基为Gibco产品；胎牛血清为杭州四季青产品；M?MLV逆转录酶和Taq酶为Promegar产品；总RNA提取试剂和Oligo(dt)15购自上海博彩公司；抗SHP1多克隆抗体购自BD Transduction Laboratories公司；RIPA细胞裂解液和低分子量蛋白Marker购自上海申博生物公司；人红白血病细胞HEL和CML急变K562细胞在含100 mL/L胎牛血清的PRMI1640培养液中，于37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度的培养箱中培养, 每24～36 h传代1次, 取对数生长期细胞进行实验.表111名CML患者的临床资料序

    1.2方法

    1.2.1CML患者SHP1 mRNA的表达SHP1上游引物：5′ACATTCTCCCCTTTGACC 3′，下游引物：5′CTCAGGTACTGGTAATGCC 3′，扩增产物414 bp［1］. 细胞中甘油醛3?磷酸脱氢酶（GAPDH） cDNA的水平也被检测作为内对照，GAPDH上游引物：5′AATCCCATCACCATCTTCCA 3′，下游引物：5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3′，扩增产物590 bp. 实验组和对照组细胞同时各取5×106，Trizol提取总RNA. 反转录体系25 μL，包括RNA 2 μg，引物Oligo(dt)15 0.5 μg，RNasin 500 nkat，4种dNTP浓度各为500 μmol/L，M?MLV逆转录酶3334 nkat，42℃反转录1 h，95℃ 5 min结束反应. PCR反应体系为20 μL，包括反转录产物2 μL，寡核苷酸引物各20 pmol，4种dNTP浓度各为200 μmol/L，Taq酶6.7 nkat. 扩增条件：94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 60 s，循环 29次，72℃ 10 min结束反应. 扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像光密度分析仪记录图像并行吸光度分析，视频打印结果.

    1.2.2RT?PCR克隆SHP1基因全长cDNA序列上游引物：5′ATAAGCTT HindⅢ GATGGTGAGGTGGTTTC 3′；下游引物：5′GCCACCTGAGGACAGCTTAAG EcoRIAT 3′. 在上游引物5′末端引入HindⅢ酶切位点, 在下游引物3′末端引入EcoRI酶切位点. 取1×107个HEL细胞，Trizol提取总RNA. PCR反应体系为25 μL，包括反转录产物3 μL，寡核苷酸引物各20 pmol，4种dNTP浓度各为200 μmol/L，Taq酶6.7 nkat. 扩增条件：95℃ 45 s，65℃ 45 s，72℃ 60 s，循环32次，72℃ 10 min结束反应. 取PCR产物10 μL，于10 g/L琼脂糖电泳，70 V恒压电泳60 min后于凝胶图像光密度分析仪下观察并记录图像，视频打印结果.

    1.2.3真核表达载体的构建及鉴定PCR产物与真核载体pcDNA3.0同时用HindⅢ与EcoRI作双酶切,胶回收试剂盒加收酶切片段, 用T4链接酶于16℃连接过夜. 反应体系为10 μL，包括SHP1 4 μL，pcDNA3.0 2 μL，T4连接酶50 nkat. 反转录条件：42℃ 60min，99℃ 5 min. 取所有连接产物转化感受态JM109细菌，涂LB＋Amp的平板，12～14 h后挑取单个菌落，经扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，酶切分析鉴定是否有片段插入及大小是否正确，将酶切分析正确的质粒定义为pcDNA3?SHP1. 酶切分析正确的pcDNA3?SHP1质粒送上海申友生物公司. 测序结果于NCBI网站用BLAST软件进行序列比较分析，确认克隆的SHP1基因序列正确后，将原克隆细胞进行中等量扩增，按聚乙二醇沉淀法中量抽提和纯化质粒. 取等量K562，pcDNA3?SHP1及pcDNA3.0转基因后的K562细胞总蛋白提取物，加入等体积2×电泳上样缓冲液，100℃加热5 min，高速离心10 s；样品及蛋白分子质量标准各25 μg于100 g/L SDS?PAGE胶上150 V恒压电泳2～3 h；考马斯亮蓝染色2～3 h；考马斯亮蓝染色脱色液脱色后蛋白分子质量标准切胶. 按Protein Detector Western Blot Kid BCIP/NBT试剂盒操作说明进行硝酸纤维素膜电转膜、1×Detector Block液进行膜封闭、一抗孵育1 h，1×Wash Solution洗膜、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，洗膜、BCIP/NBT磷酸酶底物孵育10～15 min至显色；将膜浸入水中2～3 min终止反应，空气干燥，在Adobe Photoshop软件支持下进行图像扫描存储.

    2结果

    2.1SHP1 mRNA在CML患者单个核细胞中的表达靶基因PCR与内参GAPDH的PCR 10 g/L琼脂糖凝胶电泳，以正常人作为对照；凝胶光密度分析仪测量各样本的SHP1/GAPDH的ration值（图1）. 比较正常对照组（ration=0.198±0.046）与CML?CP患者（ration=0.127±0.047）SHP1/GAPDH的RT?PCR产品吸光度ration值，结果用2?Independent Sample Tests统计法进行检验，发现两组间SHP1的表达无差异（P=0.087）；但CML?BC组（ration=0.054±0.011）与正常对照比较，SHP1 mRNA水平下调，存在统计学差异（P=0.034）.

    A: 半定量RT?PCR; B: SHP1/GAPDH条带强度的吸光度分析. 1～7: 慢性期患者; 8～11: 急变期患者; M: marker.

    图1慢性粒细胞患儿骨髓单个核细胞SHP1 mRNA表达

    2.2RT?PCR克隆全长SHP1基因按RT?PCR法克隆的PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见一阳性条带，位于2 kb片段附近，与SHP1的cDNA读码框长度相近.

    2.3SHP1基因及载体的酶切与测序鉴定克隆的SHP1基因成功地定向克隆入真核表达载体pcDNA3.0内，酶切分析正确，测序正确. 建立的载体定义为pcDNA3?SHP1.

    2.4pcDNA3.0?SHP1真核载体表达产物Westen Blot检测结果显示，pcDNA3?SHP1转基因后的K562细SHP1蛋白表达阳性，对照组K562及pcDNA3.0转基因的K562细胞未见SHP1蛋白表达（图2）.

    1: K562细胞; 2: pcDNA3.0转染的K562细胞; 3: pcDNA3?SHP1转染的K562细胞; M: marker.

    图2SHP1表达的Western Blot分析

    3讨论

    SHP1是PTP家族重要成员，几乎表达于所有的造血细胞系中，它通过与PTK成员结合或使其底物的Tyr残基去磷酸化而拮抗PTK在多个生长、分化、凋亡等信号通路中酶活性并对这些通路起负性调控作用，且对具有异常激活PTK活性的多个癌蛋白激活的信号通路中也发挥了“抑癌基因”的功能. 对肿瘤分子遗传学的深入研究表明，恶性分子事件导致异常PTK活性癌蛋白的产生是肿瘤发生的重要原因，更多的肿瘤在恶性转化所涉及的信号通路中也常有PTK成员的参与. 在造血因子受体介导的信号通路中SHP1与许多PTK关系密切，它可以通过SH2结构域与PTK结合而对信号通路产生负性调节，反过来许多PTK成员也可以调节SHP1在胞内的表达程度. 大多数研究认为，SHP1确实能够拮抗肿瘤中异常激活的PTK活性和/或催化信号通路中某一关键的PTK去磷酸化失活，从而抑制肿瘤的恶性转化能力［1-5］. 在对CML的研究中，Liedtke等［6］发现SHP1能与P210BCR?ABL结合并负性调节P210BCR?ABL/SAPK通路的信号强度，SHP1转基因在纤维母细胞中可以降低P210BCR?ABL的肿瘤转化作用也得到了证实. 最新一项研究显示，SHP1在CML急性期患者中的表达较慢性期患者明显下降，并且与DNA甲基化、突变无关，可能是转录后修饰的结果［7］. 但是目前对SHP1在CML发病、中的作用仍然知之甚少.

    我们应用RT?PCR对11例CML原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平进行了半定量检测. 结果7例慢性期患者SHP1转录本水平与正常对照无差异，但急变期患者SHP1转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异. 结合我们之前的实验结果?人CML急变细胞株K562细胞SHP1的失表达现象，提示我们P210BCR?ABL与SHP1可能存在某种功能上的联系，是否SHP1的“沉默”更促进了P210BCR?ABL的功能，使得这急变细胞较慢性期CML细胞具有更多的恶性特征如分化受阻、对凋亡更为耐受？或者是由于CML由慢性期朝加速/急变期演化过程中，Bcr?Abl本身会出现DNA剂量倍增（双Ph染色体）、mRNA转录本上升和蛋白表达水平上调，它们的改变直接导致了SHP1基因的失表达或表达下调？也许这两种因素都存在. 本研究结果目前并不能回答这一问题，它需要更深入的研究例如建立Bcr?Abl基因可调控表达模型以观察SHP1基因相应的表达情况等. 我们克隆了SHP1全长cDNA序列，构建真核表达载体以用于下一步的深入研究. 我们用技术较成熟的RT?PCR法来克隆SHP1全长cDNA序列，按照GeneBank提供的SHP1（M77273）全长序列我们用Primer Premier5软件设计了包括两个不同酶切位点的上下游引物，应用高保真酶对SHP1基因进行了克隆. 在此基础上进一步构建了pcDNA3?SHP1真核表达载体，酶切与测序结果支持了RT?PCR克隆的SHP1基因序列的正确性，Westen Blotting结果证实该载体可表达SHP1蛋白，为进一步探讨SHP1在CML发病及进展中的潜在作用打下了基础.

【】
  ［1］ Gupta R, Chakrabarti P, Dikshit M, et al. Late signaling in the activated platelets upregulates tyrosine phosphatase SHP1 and impairs platelet adhesive functions: Regulation by calcium and Src kinase［J］. Biochim Biophys Acta, 2007,1773(2):131-140.

［2］ Han Y, Amin HM, Franko B, et al. Loss of SHP1 enhances JAK3/STAT3 signaling and decreases proteosome degradation of JAK3 and NPM?ALK in ALK anaplastic large?cell lymphoma［J］. Blood, 2006,15:108(8):2796-2803.

［3］ Honorat JF, Ragab A, Lamant L, et al. SHP1 tyrosine phosphatase negatively regulates NPM?ALK tyrosine kinase signaling［J］.Blood, 2006,15,107(10):4130-4138.

［4］ Adachi T, Wienands J, Wakabayashi C, et al. SHP?1 requires inhibitory co?receptors to down?modulate B cell antigen receptor?mediated phosphorylation of cellular substrates［J］. J Biol Chem, 2001, 276:26648-26655.

［5］ Roskoski R Jr. Signaling by Kit protein?tyrosine kinase?the stem cell factor receptor［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2005,337(1):1-13.

［6］ Ito Y, Pandey P, Sathyanarayana P, et al. Interaction of hematopoietic progenitor kinase 1 and c?Abl tyrosine kinase in response to genotoxic stress［J］. J Biol Chem, 2001, 276:18130-18138.

［7］ Amin HM, Hoshino K, Yang H, et al. Decreased expression level of SH2 domain?containing protein tyrosine phosphatase?1(Shp1) is associated with progression of chronic myeloid leukaemia［J］. J Pathol, 2007, 212(4):402-410.