大鼠胰腺β细胞分泌颗粒内钙离子超微结构定位的研究

【摘要】  　　目的： 观察大鼠胰腺β细胞内钙离子在亚细胞水平的分布情况. 方法： 用胶原酶原位灌注法分离大鼠胰岛,在含100 mL/L胎牛血清、11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI-1640培养基中培养过夜后,离心,将胰岛细胞团分为实验组（外源性胰岛素100 mU/L孵育240 min）和对照组（外源性胰岛素100 mIU/L孵育0 min），采用改进的焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法对胰腺β细胞分泌颗粒内钙离子进行超微结构定位. 结果： 超微结构显示胰腺β细胞内钙离子呈高密度的黑色颗粒状. 对照组的胰岛素分泌颗粒内钙离子沉积明显高于实验组，并伴有钙离子外排. 实验组胰腺β细胞靠近细胞膜区钙离子沉积增加. 结论： 离子细胞化学定位法是研究组织中钙离子分布的有效方法. 胰腺β细胞的分泌功能可能与胰岛素分泌颗粒内钙离子浓度密切相关.

【关键词】  焦锑酸钾 钙离子 超微结构 胰腺β细胞

　　0   引言     
   
　　在胰腺β细胞中，胰岛素分泌量的绝对或相对不足会导致糖尿病的发生［1］. 大量研究表明［2-3］，β细胞内胰岛素分泌颗粒胞裂外排分泌胰岛素是由细胞内Ca2+浓度的升高直接触发的. 其中，细胞内Ca2+的升高主要来源于质膜上钙通道的Ca2+内流和胞内钙库Ca2+释放，进而使得Ca2+在通道口周围形成局部的钙离子微区（Microdomain）,钙微区中的Ca2+靠近分泌颗粒的释放位点，其较少数量的增加就能有效的加强和触发分泌颗粒的分泌，而分泌颗粒作为一种重要的钙库，对胰岛素分泌的调控作用并不清楚，且目前就胰腺β细胞内钙离子从亚细胞水平进行定位、定量分析的研究报道还比较少. 因此，我们采用改进的焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法，观察了外源性胰岛素作用胰腺β细胞后分泌颗粒内钙离子的变化，探讨分泌颗粒内钙离子在胰岛素分泌中的作用及钙离子超微结构定位的方法.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   成年雄性SD大鼠16只，体质量250～300 g（第四军医大学实验动物中心），胶原酶V,Histopaque-1077,HEPES（Sigma公司）；RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清（Gibco公司）；人胰岛素（诺和诺德医药公司）；其他试剂均为国产分析纯. 胶原酶液的配制：NaCl 124 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，CaCl27.5 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO32.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 3 mmol/L，V型胶原酶 0.5 g/L,调pH 至7.8.细胞培养基为添加有100 mL/L灭活胎牛血清的RPMI-1640 培养基. JEM-2000EX型透射电镜（日本JEOL公司）.

　　1.2   方法

　　1.2.1   大鼠胰岛原代分离培养   按Burghen 等 ［4］的方法稍加修改分离胰腺. 用200 g/L乌拉坦 按7 mL/kg腹腔注射麻醉固定. 剖腹充分暴露胰腺,无菌条件下在胆总管内插入4.5号头皮针,破心放血处死,经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5 g/LV型胶原酶液8～10 mL,使胰腺膨胀,迅速摘取整个胰腺,移入预置6mLHanks液的消化瓶中,于38℃水浴静止消化10min,振荡15s使其呈细砂状,加入4℃纯小牛血清10mL与4℃Hanks液30mL终止消化. 40目不锈钢丝网过滤,弃去未完全消化的组织,细胞悬液1000r/min离心2min,弃上清液,沉淀物加入4℃Hanks液洗涤，同样方法离心洗涤2～3次,弃上清液，于沉淀物中加入Histopaque-1077 约5 mL充分混匀,移入15 mL离心管中,沿管壁缓慢加入5 mLHanks,2000 r/min离心20 min. 以特制吸管吸取Hanks与Histopaque-1077形成的界面上的细胞团置于培养皿中. 体视显微镜下手捡胰岛,弃除过大或过小的细胞及杂质. 于超净台内以无菌Hanks液洗3～4遍,置含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基,在37℃，950 mL/L空气，50 mL/LCO2的培养箱中培养过夜.

　　1.2.2   Ca2+的细胞化学定位   ［5-6］的方法并稍加修改. 将培养过夜的胰岛细胞悬液倒出，1000 r/min离心2 min，胰岛细胞团均分两组，分别加入外源性胰岛素100 mU/L悬浮混匀孵育0 min（对照组）和240 min（实验组）后，用Hanks液洗涤2遍终止孵育. 再将离心后的胰岛细胞团迅速固定于30 mL/L戊二醛-90 mmol/L草酸钾（8.29 g草酸钾+500 mL生理盐水,pH7.4）,室温2 h或4℃冰箱过夜. 75 g/L蔗糖-90 mmol/L草酸钾洗涤3次,每次30 min. 用10 g/L锇酸-20 g/L焦锑酸钾在4℃冰箱固定2 h，双蒸水清洗15 min. 丙酮梯度脱水、EPON812浸透包埋、半薄切片定位、LKBNoVa型超薄切片机切片、经15 ml/L醋酸双氧铀和柠檬酸铅电子双重染色、用透射电镜观察和拍照. 细胞中游离Ca2+与焦锑酸钾形成焦锑酸钙沉淀，此沉淀在电镜下呈高电子密度的黑色颗粒,以此黑色颗粒进行定位定量分析. 钙离子颗粒分布的半定量分析： 在焦锑酸钾沉淀的基础上，随机选取10个胰岛β细胞，每个β细胞选取5个分泌颗粒，用图像分析软件image pro plus分析每个分泌颗粒单位面积（μm2 ）上的钙离子沉积颗粒数即钙离子平均密度. 再对50个分泌颗粒的钙离子平均密度均数和标准差.
    
　　统计学处理：实验结果用x±s表示，两组间比较采用SPSS 10.0软件进行t检验. 以P<0.05认为具有统计学差异.

　　2   结果
   
　　对照组胰腺β细胞内Ca2＋颗粒主要分布在胰岛素分泌颗粒内(图1A，B)，也可见胞质内少量沉积，该沉积物的密度比胞质中核糖体颗粒密度高，且不均一. 部分分泌颗粒处于胞吐状态，有钙离子外排现象. 实验组靠近细胞膜区分泌颗粒内钙离子沉积明显减少,近膜胞质区钙离子沉积增加(图1C). 对照组胰腺β细胞分泌颗粒内钙离子平均密度为229±7，实验组为148±8，较对照组的钙离子平均密度明显减少（P<0.01）. 

　　A: 对照组   TEM×25000（箭头所示分泌颗粒处于分泌状态）； B：对照组胰腺β细胞分泌颗粒内钙离子沉积   TEM×75000（箭头所示钙离子沉积颗粒. 胞质内可见少量沉积 ）； C：实验组胰腺β细胞内钙离子分布TEM×30000（箭头所示分泌颗粒锚定在细胞膜上，粗箭头所示近膜胞质区钙离子沉积颗粒）.PM: 细胞膜； ins: 胰岛素分泌颗粒； cyt： 胞质.

　　图1   胰腺β细胞内钙离子（略）

　　3   讨论
   
　　我们采用焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法显示正常大鼠胰腺β细胞的胰岛素分泌颗粒内有大量的钙离子沉积，发生胞吐的分泌颗粒内钙离子伴随胰岛素内容物一起外排. 这种细胞化学钙染色直观可靠的反应了钙离子在亚细胞水平的定位和分布变化. 与钙离子荧光探针通过相对荧光强度反应细胞内钙离子浓度有很大的不同. 我们通过反复摸索，成功对胰腺β细胞内的钙离子进行了超微结构定位，为进一步的实验提供了有力的试验依据. 细胞化学钙染色成功的关键在于分离的胰岛过夜修复后，再经实验处理要及时快速固定，以使超微结构保存良好，同时钙化学反应要充分. 后固定液中焦锑酸钾的终浓度为20 g/L. 由于焦锑酸钾难溶于水，配制时可采用将双蒸水加热至沸腾，然后加入焦锑酸钾，置于磁力搅拌器上溶解. 将pH值调至7.8～8.0，可保持溶液澄清透亮而不易沉淀.
   
　　此外，我们发现用外源性胰岛素孵育胰岛240 min后：近膜区胰岛素分泌颗粒内钙离子沉积明显减少，近膜胞质区钙离子沉积增加. 有研究证明，钙离子升高直接触发了胰岛素分泌. 分泌颗粒是胰腺β细胞内含钙量最高的钙库［7］，Scheenen 等［8］在INS-1β细胞中，通过排空酸性（大部分是分泌颗粒）钙库，抑制了胰岛素分泌. 因而我们推测分泌颗粒内钙离子直接参与触发分泌颗粒膜与质膜的融合，对触发胰岛素分泌在空间和时间上表现出极大的优越性和有效性. 分泌颗粒内高浓度钙离子是维持正常的胰岛素分泌功能所必须的.

【】
  　　［1］ Polonsky KS. The beta-cell in diabetes: from molecular genetics to clinical research［J］. Diabetes,1995,44(6):705-717.

　　［2］ Ashcroft FM,Proks P,Smith PA,et al. Stimulus-secretion coupling in pancreatic beta cells ［J］. J Cell Biochem,1994,55 (Suppl):54-65.

　　［3］ Rutter GA,Tsuboi T,Ravier MA. Ca2+ microdomains and the control of insulin secretion［J］. Cell Calcium,2006,40(5-6): 539-551.

　　［4］ Burghen GA,Murrell LR. Factors influencing isolation of islets of Langerhans［J］. Diabetes,1989,38(Suppl 1):129-132.

　　［5］ Lesh RE,Nixon GF,Fleischer S,et al. Localization of Ryanodine Receptors in Smooth Muscle［J］. Circ Res,1998,82(2):175-185.

　　［6］ YU F,DING YL. Ultracytochemical localization of Ca2+ during the phloem ganglion development in Phyllostachys edulis［J］. Front Biol China,2006,3: 219-224.

　　［7］ Hao M,Li X,Rizzo MA,et al. Regulation of two insulin granule populations within the reserve pool by distinct calcium sources［J］. J Cell Sci,2005,118(Pt 24):5873-5884.

　　［8］ Scheenen WJ,Wollheim CB,Pozzan T,et al. Ca2+ depletion from granules inhibits exocytosis. A study with insulin-secreting cells［J］. J Biol Chem,1998,273:19002-19008.