肾功能衰竭透析并发淀粉样沉积内存有脂蛋白

              作者：赵辉，刘金平，郑芳，崔秀凤，孙续国   

【摘要】  目的：研究脂蛋白是否与淀粉样沉积共存，探讨脂蛋白与透析相关淀粉样沉积形成的关系. 方法：肾功能衰竭透析淀粉样沉积症(DRA)手术患者15例，腕关节韧带和椎间盘组织进行刚果红染色结合偏振光诊断淀粉样沉积；Sudan Black B染色鉴别是否有脂质存在；抗人血清β2?microglobulin（β2?MG）抗体免疫组织化学染色鉴别淀粉样沉积相关蛋白类型. 结果：DRA患者椎间盘韧带组织内刚果红染色以及偏振光阳性. 连续组织切片病理形态学发现淀粉样沉积阳性范围与脂肪染色阳性相同；并且与抗人血清β2?MG抗体、抗高密度脂蛋白(HDL)抗体免疫组织化学反应与淀粉样沉积阳性部位范围重合. 结论：DRA患者β2?MG相关淀粉样沉积内存有HDL.

【关键词】  脂蛋白；淀粉样变；免疫组织化学；β2?球蛋白

　　【Abstract】 AIM: To examine the effect of lipoproteins on β2?microglobulin?related amyloidogenesis. METHODS: The levels of β2?microglobulin in 15 dialysis related amyloidosis (DRA) patients were determined by Conge red staining and polarized light diagnosis. Lipoprotein expression was examined by Sudan Black B staining. The anti human plasma high density lipoprotein (HDL) antibody and anti?β2?MG antibody immunoreactions were compared with Conge red positive reaction in amyloid deposed tissue in the DRA patients.  RESULTS: Congo red positive reaction and anti?HDL immnoreaction co?localized in the DRA patients; the Congo red positive result co?localized with anti?β2?MG and anti?HDL immnoreactivation.  CONCLUSION: The HDL co?localizes with amyloid deposits in DRA patients and maybe it is associated with β2?microglobulin amyloidogenesis.

　　【Keywords】 lipoprotein; β2?microglobulin; dialysis related amyloidosis; immunohistochemistry

　　0引言

　　β2?microglobulin(β2?MG)是组织相融抗原四聚体的轻链，除成熟的红细胞和胎盘滋养层细胞以外，其他细胞均含有β2?MG，在免疫识别、免疫调节等方面发挥生物学作用［1-2］. 肾小球单位损害患者血液中β2?MG蛋白浓度增加. 随着血液透析时间的延长，发现淀粉样变沉积于椎间盘和关节韧带等组织，通过蛋白类型鉴定证明淀粉样沉积的蛋白纤维为β2?MG. 但免疫清除血浆中的β2?MG蛋白，未能降低透析相关淀粉样沉积症(dialysis related amyloidosis, DRA)的发生率［3］. 另外最近研究发现Apolipoprotein A1能够形成淀粉样沉积蛋白纤维，Apo E4基因多态性与脑淀粉样沉积形成密切相关［4］. 我们研究DRA患者椎间盘韧带和腕关节韧带组织内淀粉样沉积病理形态学特点以及脂蛋白沉积的特点，探讨脂蛋白在淀粉样沉积形成关系.

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　临床症状及病理形态学检查诊断为肾功能衰竭透析5 a以上患者15（男9，女6）例，年龄45～68岁. 所有患者均行血清、尿液检查、肾功能检查，采血液后立即分离血清，分析血清β2?MG蛋白水平. 所有DRA患者手术标本，均-80℃和福尔马林两种方式保存.

　　1.2方法

　　血清稀释后，取稀释液体100 μL加入预先包被的测定β2?MG反应板内，室温反应1 h. PBS洗涤3次后，加入1∶500稀释抗人血清β2?MG抗体（Dako, Glostrup, Denmark）100 μL，室温反应1 h，用酶标记二抗，室温反应1 h，利用DAB显色，血清β2?MG蛋白的浓度. 另标准冰冻切片，用500 mL/L甲醇溶液作用2 min，重复2次. 5 g/L Sudan Black B（700 mL/L甲醇）溶液，37℃条件下作用1 h. 重蒸馏水洗涤3次，核染色5 min. 标准冰冻切片与5 g/L过碘酸钠PBS pH 7.4缓冲液反应8 min，流水洗涤5 min. 抗人血浆HDL抗体(AssayPro, Winfiled,ＭＯ， USA) 37℃条件下反应1 h，PBS洗涤3次. DAB?Tris?HCl pH 7.6缓冲液，H2O2混合液（Dako, Glostrup, Denmark）作用3 min. 连续病理切片利用显微影像系统分析刚果红染色与脂质染色程度的相关性.

　　统计学处理：计量资料用x±s表示，两组比较用t检验.

　　2结果

　　患者（n=15）血清β2?MG （3.28±0.98） mg/L比正常人(n=20)血清β2?MG水平 (1.08±0.16) mg/L高（P<0.05）. DRA患者椎间盘韧带或腕关节韧带组织经刚果红染色显红色，可见绿色偏振光，确定为淀粉样沉积阳性. 连续组织切片Sudan black B染色范围与刚果红染色阳性范围完全重合(图1). 抗血浆HDL抗体免疫化学反应范围与脂质染色、刚果红染色阳性，淀粉样沉积部位以及脂肪沉积部位重合(图2). 以刚果红染色为基准，利用显微镜影像分析系统，将刚果红染色划分为4个等级，分别测定、与刚果红染色相同范围脂质染色和高密度脂蛋白(HDL)免疫组织化学染色程度，结果显示在刚果红染色40%程度，脂质染色和HDL免疫组织化学反应相关性最强（图3）.

　　3讨论

　　DRA患者透析1 a以上开始出现淀粉样沉积. 我们收集持续血液透析5 a以上患者，并发有椎间盘损坏或腕关节综合征患者，手术取材分析软组织淀粉样沉积内存有HDL. 所有DRA患者肾功能损害患者组β2?MG与正常对照组相比明显增加. 在15例DRA患者中，8例椎间盘韧带组织；7例腕关节韧带组织经刚果红染色均发现染红色，并且偏振光阳性，不同患者的刚果红染色阳性程度不同. 但是组织内均有淀粉样沉积形成（图1）. 所有椎间盘韧带、腕关节韧带组织，连续病理切片Sudan Black B，在刚果红染色呈红色范围，脂质染色为蓝色，呈脂质沉积阳性，脂肪染色阳性范围与刚果红染色重合（图2）. 该实验结果说明组织淀粉样沉积内存有脂肪成分.

　　根据刚果红染色程度，利用影像分析系统划分4个等级（A：25%；B: 40%；C: 75%; D: 100%）.

　　分析15例DRA患者椎间盘韧带和腕关节韧带组织内刚果红染色和Sudan Black B染色阳性范围与其相对应，可见抗血浆HDL抗体免疫化学阳性反应. 相同和不同脏器组织内，淀粉样沉积阳性部位均存有HDL成分；相同组织和相同组织结构（椎间盘韧带、腕关节韧带）阴性对照部位，未见有抗血浆HDL抗体免疫化学反应阳性. 以上结果说明，DRA患者组织淀粉样沉积内存有血浆HDL成分或存有代谢变化的HDL，但是含有血浆HDL的抗原成分. 总之，肾功能衰竭透析患者并发β2?MG蛋白相关淀粉样沉积内存有HDL.

【】
  　　［1］Dimaano C, Nguyen T, Ahmed A,et al. A point mutation in beta2?microglobulin results in loss of epitope expression［J］. Tissue Antigens, 2000,56:473-475.

　　［2］Kingsbury DJ, Mear JP, Witte DP,et al. Development of spontaneous arthritis in beta2?microglobulin?deficient mice without expression of HLA?B27: Association with deficiency of endogenous major histocompatibility complex class I expression［J］. Arthritis Rheum, 2000,43:2290-2296.

　　［3］Motomiya Y, Ando Y, Haraoka K,et al.Circulating level of alpha2?macroglobulin?beta2?microglobulin complex in hemodialysis patients［J］. Kidney Int, 2003,64:2244-2252.

　　［4］Hamidi AL, Liepnieks JJ, Hamidi AK,et al. Hereditary amyloid cardiomyopathy caused by a variant apolipoprotein A1［J］. Am J Pathol,1999,154:221-227.

　　［5］Ameer GA, Grovender EA, Ploegh H,et al. A novel immunoadsorption device for removing beta2?microglobulin from whole blood［J］. Kidney Int, 2001,59(4):1544-1550.

　　［6］Sun X, Ueda M, Yamashita T,et al. Lipid droplets are present in amyloid deposits in familial amyloidotic polyneuropathy and dialisis related amyloidosis ［J］. Amyloid, 2006,13:20-23.