水飞蓟素可通过MAPK信号转导通路促进肺腺癌A549细胞凋亡

            作者：李文海，梁军，王春梅，刘楠楠，田菲，胡运生，刘锟  

【摘要】  目的：探讨水飞蓟素(SM)对人肺腺癌细胞(A549)的抗癌作用及其分子机制. 方法：采用倒置显微镜和显微镜等形态学检测、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪(FCM)技术结合PI及Annexin V双标记染色以及MAPK的磷酸化活性检测方法. 结果：SM对人肺腺癌A549细胞的增殖有抑制作用；SM作用A549细胞48 h后，随着浓度的增加，倒置显微镜下可见细胞数目减少，有些细胞变小、变圆；透射电镜观察发现，随着SM作用浓度的增加，A549细胞中逐步出现增多的凋亡细胞，凋亡细胞表现出典型的超微结构特征；流式细胞仪检测的结果发现，随着药物作用时间的延长，A549细胞的G1期细胞比例增多，S期细胞明显减少，G2期细胞略有减少，并出现一明显的凋亡峰. SM可以抑制A549细胞中ERK的活性，并在一定程度上提高p38和JNK的活性. 结论：SM可以在体外抑制人肺腺癌细胞A549的增殖作用，并诱导其凋亡. SM可能通过抑制A549细胞中ERK的活性，并提高p38和JNK的活性发挥其诱导作用.

【关键词】  水飞蓟素；肺肿瘤；腺癌；细胞系；凋亡； MAPK信号通路

　　【Abstract】 AIM: To study the anticancer effect and the molecular mechanism of silymarin on human lung adenocarcinoma cell line A549. METHODS: The morphological characters of apoptosis induced by silymarin were studied and analyzed by inverted microscopy, electron microscopy, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay, combination of flow cytometry (FCM) and Annexin V/Propidium Iodide double staining, and detection of phosphorylation activity of MAPK. RESULTS: Silymarin had a significant inhibitory effect on the proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549; treated with silymarin  for 48 h, some of the cells became smaller and looked more round than before; The number of A549 cells showing apoptosis increased with elevation of the concentration of the silymarin, and these cells appeared typical ultrastructural features; the results of FCM indicated that the proportion of A549 cells in G1 phase increased, while the number of cells in S phase decreased significantly and those in G2 phase reduced slightly but presented a marked apoptotic peak. Silymarin had an ability of inhibiting the activity of ERK and increasing the activities of p38 and JNK to some degree in A549 cells. CONCLUSION: Silymarin can inhibit the proli?feration of human lung adenocarcinoma cell line A549 in vitro and induce its apoptosis possibly through inhibiting the activity of ERK and increasing the activities of p38 and JNK in A549 cells.

　　【Keywords】 silymarin; lung neoplasms; adenocarcinoma; cell line; apoptosis; MAPK signal pathway

　　0引言

　　水飞蓟素（silymarin，SM）是从植物水飞蓟中提取的一种黄酮类抗氧化剂，具有抗脂质过氧化、清除自由基、抑制5?脂氧合酶、维持细胞膜稳定性、促进肝细胞再生及降血脂等作用，具有较强的肝脏保护作用，常用来肝纤维化、乙醇相关性肝病等［1］. 近年来的研究发现，SM可以通过诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡、抑制新生血管生成等机制，抑制如前列腺癌、皮肤癌、结肠癌、白血病等肿瘤细胞的增殖作用，但目前对其抗肿瘤的机制尚无统一认识［2］. 为了明确SM对肺癌细胞增殖的作用以及其在临床应用的前景，我们研究了SM对人肺癌细胞系A549的作用，并初步探讨了其抑制肿瘤细胞的机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人肺腺癌A549细胞系购于中科院上海细胞生物研究所细胞库. SM购于药品生物制品检定所. 无菌条件下，DMSO溶解后，用RPMI?1640培养液稀释至所需浓度. 抗非磷酸化及抗磷酸化MAPKs抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)公司；HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗购自武汉博士德公司；溴化乙啶(EB)、RNA酶A、蛋白酶K与噻唑盐(MTT)为Sigma公司产品 (MO，USA)；RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco(USA)公司产品；DMSO为Sigma(USA)公司分装；PMSF购自BIB(USA)公司；硝酸纤维素(NC)膜购自Amersham(SE)公司.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养人肺腺癌A549细胞接种于25 mL培养瓶，培养液为含100 mL/L胎牛血清、1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640，置于37℃, 50 mL/L CO2, 饱和湿度细胞培养箱中培养.

　　1.2.2四唑兰显色法(MTT法)观察SM对肺腺癌A549细胞增殖的影响2.5 g/L的胰蛋白酶消化对数期生长的细胞，悬浮于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度为1.5×107/L，接种于96孔培养板，每孔100 μL，培养24 h后，分别加入含有不同浓度SM的RPMI 1640培养液100 μL，使SM的终浓度为5，10，15，20，40 mg/L. 同时设阴性对照组、空白对照组，阴性对照组为只加含有DMSO的RPMI 1640培养液，空白对照组为不加细胞而只加培养基，每组设三个复孔，培养24, 48, 72 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h后，吸去上清液，加入150 μL的DMSO液，振荡培养板10 min，用酶标仪检测，检测波长为490 nm，波长630 nm.

　　1.2.3倒置显微镜观察细胞形态学的变化实验条件同1.2.1，使SM的终浓度分别为0，10，20，40 mg/L，培养48 h后在倒置显微镜下观察、照相.

　　1.2.4透射电镜观察细胞超微结构20 mg/L SM作用A549细胞12，24，48 h后，2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，用含100 mg/L血清的RPMI 1640培养液悬浮细胞，将细胞悬液移入10 mL玻璃离心管中，1000 r/min离心5 min，弃上清液，再用1 mL新鲜培养液重新悬浮细胞，然后将细胞悬液移入1.5 mL的EP管中，1500 r/min离心15 min后，吸去上清液，沿管壁缓慢加入4℃预冷的2.5 mL/L戊二醛固定细胞沉淀，送电镜室，包埋切片后，观察照相.

　　1.2.5流式细胞术（FCM）测定细胞周期20 mg/L SM分别作用A549细胞24，48 h后，2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，500 r/min离心5 min收集细胞，弃去上清，用PBS洗涤细胞2次. 用0.9 mL PBS悬浮细胞制成单细胞悬液，缓慢加入2.1 mL纯乙醇，使乙醇终浓度达750 mL/L以固定细胞，置4℃过夜. 离心弃乙醇，用PBS洗涤细胞2次. 用100 μL PBS悬浮细胞，加碘化丙啶染色液300 μL，作用15 min. 流式细胞仪测定细胞周期，观察G1期、G2期、S期各期细胞所占的百分比，观察是否存在凋亡峰.

　　1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡分别用终浓度为10，20，40 mg/L SM作用A549细胞48 h后，2.5g/L胰蛋白酶溶液消化，500 r/min离心5 min收集细胞，吸弃上清，用PBS洗涤细胞2次. 后续步骤按照AnnexinⅤ?FITC试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪定量分析细胞凋亡水平.

　　1.2.7Western Blot检测MAPKs信号转导通路相关分子的表达用终浓度分别为0，10，15，20，40 mg/L的SM作用A549细胞48 h后加入适量的RIPA裂解液冰浴中裂解细胞，收集蛋白，BCA法蛋白定量,取总蛋白相等的样品行120 mol/L SDS?PAGE电泳，然后电转移至NC膜上后，分别用抗非磷酸化及抗磷酸化MAPKs抗体作I抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG作II抗体，ECL发光法检测.

　　2结果

　　2.1SM对人肺腺癌 A549 细胞增殖的抑制作用SM对人肺腺癌A549细胞的增殖有抑制作用，同一时间随着浓度的增加或者同一种浓度随着时间的延长其抑瘤作用增强(P<0.01，图1). 其作用48 h的半数抑制浓度(IC50)为18.4 mg/L.

　　2.2倒置显微镜观察SM作用A549细胞后形态学的变化用终浓度分别为0，10，20，40 mg/L的SM作用A549细胞48 h后，可见随着浓度的增加，细胞数目减少，有些细胞变小、变圆，有些细胞变大、到高浓度时出现较多的死亡细胞，特别是40 mg/L SM作用A549细胞48 h后，细胞大部分死亡. 而未加药只加等量溶剂用RPMI 1640进行培养的A549细胞则生长良好，随着时间的延长，细胞数目增多，细胞密度加大（图2）.

　　2.3透射电镜观察SM作用A549细胞后细胞超微结构的变化随着SM作用时间的延长，A549细胞中逐步出现增多的凋亡细胞，凋亡细胞表现出典型的超微结构特征，如细胞膜表面微绒毛消失，核膜及细胞膜保持完整，细胞膜表面出泡，染色质浓集；在细胞凋亡早期，染色质边集，核仁存在；晚期核仁消失，染色质断裂成块，并形成凋亡小体.

　　2.4FCM检测SM对A549细胞的细胞周期的影响20 mg/L SM作用A549细胞24,48 h后，随着药物作用时间的延长，与阴性对照组相比，细胞的G1期细胞比例增多，S期细胞明显减少，G2期细胞略有减少，出现了G1期阻滞（图3）. 其中作用24, 48 h后可在细胞周期图上出现明显的凋亡峰.

　　2.5FCM检测SM诱导A549细胞凋亡率终浓度为10，20，40 mg/L SM作用A549细胞24 h后，凋亡细胞的百分比依次为10.8%.

　　2.6SM对MAPK家族成员的影响在不同浓度SM（0，5，10，20，40 mg/L）作用24 h后， ERK, JNK, P38的表达水平都没有明显的改变，而它们磷酸化的程度与加入DMSO的阴性对照组相比则有显著的改变. 其中ERK的磷酸化受到明显的抑制，而JNK, p38MAPK的磷酸化水平有一定的增加（图4）.

　　3讨论

　　中药在肿瘤疾病中既可增加化疗药及放射线的敏感性、又有放射防护作用，可减轻化疗放疗的副作用，起到抑瘤增效作用或放射增敏作用［3］. 目前天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低，受到国内外广泛的关注. 我们前期选取了多种中药提取物或单体，通过MTT实验，初步筛选出了几种能够以较低浓度抑制A549细胞增殖的药物，其中就包括SM.

　　SM近年来抗肿瘤作用日益引起人们的关注. SM能够抑制前列腺癌、皮肤乳头状瘤、结肠癌细胞、乳腺癌等细胞的增殖及诱导其肿瘤细胞凋亡［4-5］. 但目前关于SM是否也能抑制肺癌细胞增殖及其可能存在的机制研究一直未见详细报道.

　　本实验我们通过MTT法检测到SM可以抑制肺癌A549细胞的增殖，并呈时间依赖性和浓度依赖性；流式细胞仪分析结果提示SM可以引起A549细胞凋亡，并呈时间依赖性或浓度依赖性. 为了进一步探讨SM诱导A549细胞凋亡的机制，我们选择了MAPK信号转导通路进行研究，因为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞信号转导中的重要分子，广泛参与细胞的分化、增殖、恶性转化及凋亡作用. MAPK中的细胞外调节蛋白激酶（ERK）及c?Jun氨基末端激酶（JNK）与细胞调亡密切相关. 我们采用Western Blot方法，应用针对MAPK家族成员JNK, ERK, p38磷酸化形式及非磷酸化形式的特异性抗体，检测了SM作用后以上激酶的表达水平及活化程度的改变. 在不同浓度药物作用24 h后，这几种激酶的表达水平都没有明显的改变，而它们磷酸化的程度与加入DMSO的阴性对照组相比则有显著的改变. 其中ERK的磷酸化受到明显的抑制，而JNK, p38MAPK的磷酸化水平有一定的增加. 激酶的磷酸化程度体现了其活化水平，因此，我们认为SM的作用抑制了ERK的活性，而在一定程度上提高了JNK, p38的活性. 而SM对MAPK家族成员不同的调节作用与细胞的存活状态及凋亡程度可能具有一定的相关性. 该研究结果与Singh等［6］利用皮肤乳头状瘤的ENCAR小鼠动物模型验证SM的促凋亡机制所获结果基本吻合.

　　本实验证实SM能引起肺癌细胞凋亡,为进一步用于非小细胞肺癌的化疗及联合用药提供了实验依据，同时也为中西医结合治疗肿瘤提供了一个靶点.

【】
  　　［1］Bosisio E, Benelli C, Pirola O. Effect of the flavanolignans of Silybum marianum L, on lipid peroxidation in rat liver microsomes and freshly isolated hepatocytes ［J］. Pharmacol Res, 1992, 25(2): 147-154.

　　［2］Zi X, Zhang J, Agarwal R, et al. Silibinin up?regulates insulin?like growth factor?binding protein 3 expression and inhibits proliferation of androgen?independent prostate cancer cells ［J］. Cancer Res, 2000, 60(20): 5617-5620.

　　［3］徐振晔, 杨宇飞. 肺癌中西医综合治疗［M］. 北京:人民卫生出版社出版, 2002:152-157.

　　［4］Deep G, Oberlies NH, Kroll DJ, et al. Isosilybin B and isosilybin A inhibit growth, induce G1 arrest and cause apoptosis in human prostate cancer LNCaP and 22Rv1 cells［J］. Carcinogenesis, 2007, 28(7):1533-1542.

　　［5］Sagar SM. Future directions for research on Silybum marianum for cancer patients［J］. Integr Cancer Ther, 2007, 6(2):166-173.

　　［6］Singh RP, Tyagi AK, Zhao J, et al. Silymarin inhibits growth and causes regression of established skin tumors in SENCAR mice via modulation of mitogen?activated protein kinases and induction of apoptosis［J］. Carcinogenesis, 2002,23(3):499-510.