昆布水提物对人子宫内膜癌细胞系B?MD?C1（ADR+/+）多药耐药性的影响

             作者：李巧敏，连易水，张静，单保恩，赵瑞撵，沈莉 

【摘要】  目的：研究昆布提取物（TLPE）在体外对耐药细胞B?MD?C1（ADR+/+）的逆转作用，探讨其逆转肿瘤多药耐药的机制. 方法：应用流式细胞术测定不同剂量TLPE对B?MD?C1用药前后细胞内蛋白激酶C?α（PKC?α）和谷胱甘肽转移酶?π（GST?π）的表达变化，测定细胞周期和凋亡率；应用姬姆萨染色技术观察细胞形态学改变及细胞凋亡情况；应用比色法检测各组细胞ATP酶（ATPase）变化. 结果：TLPE在70～300 mg/L浓度范围内能明显降低B?MD?C1细胞内PKC?α和GST?π的表达（P<0.01），并将细胞阻滞于S期，但不诱导细胞凋亡；TLPE对细胞内ATPase无影响（P>0.05）. 结论：TLPE对子宫内膜癌细胞系B?MD?C1（ADR+/+）具有耐药逆转作用，其逆转作用与其诱导PKC?α和GST?π的表达降低有关.

【关键词】  昆布水提物；子宫内膜肿瘤；多药耐药

　　【Abstract】 AIM: To study the multidrug resistance (MDR)?reversing effect of Chinese drug Thallus Laminariae PE (TLPE) on human endometrial cancer cell line B?MD?C1 （ADR+/+） in vitro and its underlying mechanism. METHODS: The expressions of PKC?α and GST?π at the level of protein in B?MD?C1 cell treated with different doses of TLPE were analyzed by flow cytometry. The cell cycle and apoptosis rate of B?MD?C1 （ADR+/+） cells treated by TLPE were detected. Their morphological changes were observed by Gimsa staining methods. Colorimetry was used to detect the changes of ATPase on B?MD?C1 （ADR+/+） cells treated by TLPE. RESULTS: After interfered by TLPE (70-300 mg/L), the expressions of PKC?α and GST?π in cells were decreased significantly （P<0.01）. TLPE could block cell cycle at S period, but it did not obviously induce cell apoptosis. There was no significant change in the expression of ATPase on TLPE?treated cells. CONCLUSION: TLPE can reverse MDR of B?MD?C1 （ADR+/+） cell, and the mechanism may be related to the decreasing expressions of PKC?α and GST?π in cells.

　　【Keywords】  TLPE; endometrial neoplasms; multidarng resis?tance

　　0引言

　　多药耐药(multidrug resistance, MDR)的发生与多种因素有关，信号转导通路，GST?π和细胞ATP酶（ATPase）在肿瘤细胞表达与其功能发挥可能起到关键的调控作用［1］. 昆布作为传统中药，常参与抗癌中药的配伍. 昆布提取物（thallus laminariae PE, TLPE）对多种肿瘤细胞株有抑制作用，其机制主要是抑制肿瘤细胞的增殖和(或)杀死肿瘤细胞［2］. 除此之外，TLPE还可通过降低耐药细胞P?gp的表达，从而达到逆转多药耐药的作用［3］. 目前，有关昆布逆转肿瘤细胞多要耐药的作用机制还少见报道. 我们通过TLPE 对信号传导分子PKC?α，GST?π及细胞ATPase影响的体外实验研究，探讨昆布对逆转子宫内膜癌多药耐药作用的相关机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　耐药细胞株B?MD?C1（ADR+/+）和敏感细胞株B?MD?C1（wt）为河北医科大学第四科研中心保存［2］. 阿霉素（ADM，注射用盐酸多柔吡星，浙江海正药业股份有限公司）；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；鼠抗人GST?πmAb(北京中杉金桥生物技术公司)；兔抗人PKC?α多克隆抗体（武汉博士德生物技术公司）；超微量ATPase试剂盒(南京建成生物工程研究所).

　　1.2方法

　　1.2.1TLPE水提液的制备昆布干品5 g加蒸馏水100 mL浸泡过夜，100℃水浴1 h滤纸过虑除去不容物质，用无菌滤器除菌后作为昆布提取液（昆布提取液原液浓度为50 g/L），4℃冰箱保存备用.

　　1.2.2细胞培养B?MD?C1（ADR+/+）细胞在含5 mg/L ADM和10 mL/L胎牛血清RPMI 1640培养液中稳定生长. 实验前2 wk再换用无ADM的10 mL/L胎牛血清RPMI 1640培养液继续培养.

　　1.2.3细胞周期及细胞凋亡率检测调整细胞浓度为1×109/L, 加入96孔培养板中，0.1 mL/孔，加入不同浓度的TLPE，另设空白对照组，于37℃培养48 h，经PBS洗涤3次，以700 mL/L预冷乙醇4℃固定过夜，用流式细胞仪测定.

　　1.2.4细胞内PKC?α和GST?π的表达分析取对数生长期的B?MD?C1（ADR+/+）细胞和B?MD?C1（wt）细胞，用PBS调整细胞数为1×109/ L，加入相应的抗体工作液0.1 mL，室温反应1 h, 经500目铜网过滤后用流式细胞仪检测.

　　1.2.5姬姆萨染色技术观察细胞形态学变化调节B?MD?C1（ADR+/+）细胞浓度为1×108/L，接种于含灭菌盖玻片的6孔培养板中，实验组加入不同浓度（125，250 mg/L）的TLPE，对照组加入等量的RPMI 1640培养基，于37℃培养48 h，倒置显微镜下观察细胞形态学变化.

　　1.2.6化学发光法检测细胞ATPase变化收集TLPE干预后的B?MD?C1（ADR+/+）细胞和对数生长期的B?MD?C1（wt）细胞，调整细胞数为1×109/L, 用Soniprep150型超声波发生器以振幅14 μm超声处理30 s使细胞破碎成匀浆，将制备好的匀浆1000 r/min，离心5 min，取上清液进行测定.

　　统计学处理： 所有数据使用SPSS 11.5统计软件进行分析. 多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD?t检验，P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1TLPE对B?MD?C1细胞周期分布和凋亡的影响

　　经不同浓度TLPE干预后，B?MD?C1（wt）细胞的S期比例稳定，各时间段之间无统计学差异. 但B?MD?C1（ADR+/+）细胞周期的分布发生了变化：随着TLPE浓度的升高和时间的延长，B?MD?C1（ADR+/+）的S期细胞比例增高，差异具有统计学意义（P<0.01），同一剂量组TLPE作用24，48和72 h后，差异具有统计学意义（P<0.05，图1）. 细胞凋亡率在各组之间差异无统计学意义（P>0.05）.

　　2.2TLPE对B?MD?C1细胞PKC?α和GST?π表达的影响

　　随着TLPE浓度的升高和作用时间延长，B?MD?C1（ADR+/+）细胞内PKC?α和GST?π的表达量逐渐降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），不同浓度组之间差异具有统计学意义（P<0.01）.

　　2.3TLPE对B?MD?C1细胞形态学的影响

　　未用药组B?MD?C1（ADR+/+）细胞大小不一，圆形，可见瘤巨细胞，核染色深、核分裂像多见（图2A）；TLPE 125 mg/L作用后，B?MD?C1（ADR+/+）细胞体积变小，核浓缩，边集，核分裂像减少（图2B）；TLPE 250 mg/L作用后，B?MD?C1（ADR+/+）细胞体积变小更加明显，核浓缩，核分裂像少见（图2C）.

　　2.4TLPE对B?MD?C1细胞内ATPase的影响

　　不同浓度的TLPE干预后，B?MD?C1（ADR+/+）细胞内ATPase含量无明显变化，随着TLPE 浓度的增加、作用时间的延长，差异无统计学意义（P>0.05，结果未显示）.

　　3讨论

　　昆布作为传统中药，具有软坚散结之功效，常参与抗肿瘤方剂的配伍. 其药理作用广泛，生物活性众多，且毒性微小［3］. 本实验结果显示，TLPE对B?MD?C1（ADR+/+）细胞多药耐药性的影响表现在以下几个方面：① 能够抑制肿瘤细胞从S期转向G2期，从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖，并且存在着剂量和时间依赖性；② B?MD?C1（ADR+/+）细胞的形态发生显著变化；③ 逆转耐药是通过降低PKC?α和GST?π的表达，直接或间接影响P?gp的表达所致；④ TLPE影响P?gp的功能可能不是通过影响ATPase来实现的. TLPE能与P?gp糖蛋白结合，影响P?gp的功能，可能是通过其某一组分或多种组分来抑制或影响P?gp的表达，相关机制还有待进一步研究.

【】
  　　［1］Xiao Q, Dong PJ, Hu NN, et al. Experimental study of LAMS restrain multiplication of BxPC?3cells［J］. Chongqing Med, 2004, 33(3): 417-418.

　　［2］单保恩，李巧敏，张静. 昆布水提物对B?MD?C1（ADR+/+）细胞耐药性的逆转作用研究［J］. 中华肿瘤防治杂志，2006, 13(22): 1683-1685.

　　［3］张朝晖，蔡宝昌. 海洋药物研究与开发［M］. 北京：人民卫生出版社，2003：72-78.