胃癌发生发展中可溶型Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达及其意义
来源：岁月联盟
时间：2010-07-13
【关键词】 胃癌Ｆａｓ／ＦａｓＬ 基因表达 免疫逃逸 细胞凋亡
ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｆａｓ，ＦａｓＬ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆａｓ ａｎｄ ＦａｓＬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｆａｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ８5％，４5％ ａｎｄ ３7％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＦａｓＬ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ 20％，２7％ ａｎｄ ４6％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｍ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ：ｔｈｅ ＭＷ ｏｆ Ｆａｓ ｉｓ ３０ ｋＤａ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｙｌｅ ｏｆ Ｆａｓ ｉｓ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｆａｓ（ｓＦａｓ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｆａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０?０５）．ＦａｓＬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０?０５）．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｆａｓ／ＦａｓＬ；ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｅｓｃａｐｅ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 胃癌是发病率较高的恶性肿瘤之一，发病机制尚不十分清楚。Ｆａｓ（ＣＤ９５／ＡＰＯ?１）是肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一神经生长因子（ＮＧＦ）受体超家族成员，它通过与其配件（Ｆａｓｌｉｇａｎｄ，ＦａｓＬ）相互作用，调控细胞的生存和凋亡［１］。研究表明：Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统的异常表达，不仅参与胃癌过程中细胞凋亡异常的调节，而且与胃上皮细胞癌变及免疫逃逸有关［２］。本文通过检测正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织Ｆａｓ?ＦａｓＬ的表达，探讨其在胃癌发生、发展中的作用。
１ 材料和方法
１?１ 组织来源 ２０例正常胃黏膜、２２例癌前病变和３５例胃癌组织（人正常胃黏膜和胃癌手术切除）标本选自本室与医科大学附属第一肿瘤外科共建瘤库。标本在术后２ ｈ内获取，液氮速冻后，－７０℃保存。
１?２ 主要试剂 兔抗人Ｆａｓ、ＦａｓＬ抗体（Ｓａｎｔ Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）购自北京中山生物技术公司；增强化学荧光蛋白检测（ＥＣＬ）试剂盒系英国Ａｍｅｓｈａｍｅ公司产品；ＡＢＣ试剂盒为美国Ｖｅｃｔｏｒ公司产品。
１?３ 方法
１?３?１ 冰冻组织切片 将冰冻切片机（Ｌｅｉｃａ １８００型）的操作箱用１００％乙醇擦洗数次，以灭活蛋白酶；温度降至－２０℃左右，然后按常规方法做以上组织的冰冻切片。
１?３?２ 免疫组织化学染色 将上述切片做ＨＥ染色，组织病观察，选择病变典型的切片用冷丙酮固定，－２０℃保存，用于免疫组织化学染色。抗Ｆａｓ－ＦａｓＬ抗体的工作浓度均为１∶１００。以食道鳞状上皮为阳性对照。ＡＢＣ免疫组织化学染色的步骤按［３］所述方法进行。
１?３?３ 特定组织的蛋白提取 冰冻组织的连续切片，ＨＥ染色，组织病理学观察。若有多种组织存在，则按本研究室建立的特定组织选择法［４］进行蛋白提取。选择切片总体积约２ ｍｍ×２ ｍｍ×２ ｍｍ，立即用加样器吸头将其移至含５０ μｌ １２×ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ，超声破碎，加热５ ｍｉｎ，１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清，用紫外分光光度计进行蛋白浓度然后调整浓度至４ ｇ／Ｌ，－７０℃保存备用。
１?３?４ 蛋白分析 取１００ μｇ蛋白样本，在１０％ＳＤＳ?ＰＡＧＥ中电泳分离，蛋白按常规行电转移，恒流８０ ｍＡ，过夜。固相支持物为硝酸纤维素膜。５％脱脂奶粉（ＤＩＦＣＯ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ），０?５％ Ｔｗｅｅｎ?２０封闭４５ ｍｉｎ，以稀释度为１∶５００的Ｆａｓ、ＦａｓＬ抗体与膜上靶蛋白孵育４５ ｍｉｎ。辣根过氧化物酶偶联的猪抗兔抗体（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）作用后，用ＥＣＬ荧光显色系统曝光显色。
１?３?５ 统计学分析 数据进行χ２检验。
２ 结果
免疫组织化学染色的结果显示：Ｆａｓ在正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织的阳性率分别为８5％、４5％、３7％，Ｆａｓ在正常胃黏膜的表达显著高于癌前病变和胃癌组织（Ｐ＜０?０５）；ＦａｓＬ在正常胃黏膜、癌前病变、胃癌组织阳性率分别为20％、２7％、４6％，ＦａｓＬ在胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜和癌前病变（Ｐ＜０?０５）。Ｆａｓ的表达部位基本以细胞为主，表现为细胞浆呈棕黄色染色颗粒。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交显示：胃癌细胞产生的Ｆａｓ蛋白以分子量３０ ｋＤａ的可溶型Ｆａｓ（ｓＦａｓ）为主，伴少量的４３ ｋＤａ模型Ｆａｓ（ｍＦａｓ），见表1。表1 Fas和Fasl在不同组织中的表达情况
３ 讨论
恶性肿瘤的发生是一个多阶段的过程，一般表现为正常上皮、不典型增生、原位癌、浸润癌，同时肿瘤的发生是多基因变异积累的过程。近年研究发现，细胞凋亡的抑制在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。由Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统及其细胞内信号传导分子构成了细胞凋亡的重要通路，在此通路上任一环节的缺失都可导致癌细胞逃逸细胞凋亡，从而实现无限增殖［５］。本组实验结果表明：癌前病变、胃癌组织细胞Ｆａｓ阳性表达率显著低于正常胃黏膜，提示胃癌细胞Ｆａｓ下调；癌前病变、胃癌组织细胞ＦａｓＬ阳性表达率显著高于正常胃黏膜，提示胃癌细胞ＦａｓＬ上调。因此证实了胃癌组织细胞中存在Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统平衡失调，导致Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统介导的细胞凋亡途径发生异常，可能是胃黏膜癌变过程中细胞凋亡抑制的重要机制之一［６］。另外，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交显示：胃癌细胞产生的Ｆａｓ蛋白以分子量３０ ｋＤａ的可溶型Ｆａｓ（ｓＦａｓ）为主，伴少量的４３ ｋＤａ膜型Ｆａｓ（ｍＦａｓ）。胃癌细胞中缺乏膜型Ｆａｓ的表达意味着将不能与ＦａｓＬ或其重组体相结合触发凋亡。这提示：胃癌细胞可能通过大量分泌ｓＦａｓ来封闭细胞外基质中以及免疫活性细胞表达的ＦａｓＬ，以阻止后者与自身含膜内死亡区域（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ，ＤＤ）的ｍＦａｓ接触，从而使胃癌细胞获得免疫逃逸能力，使胃癌细胞得以持续增殖［７］。Ｆａｓ在胃癌发生发展各阶段中均有表达，但在表达程度上存在一定差异，即癌前病变、胃癌组织Ｆａｓ阳性表达率显著低于正常胃黏膜，表明Ｆａｓ表达异常可能在胃癌发生过程中起一定作用。在癌前病变和胃癌组织黏膜间的Ｆａｓ表达差异无显著性，说明Ｆａｓ的出现很可能是各类胃癌及癌前病变的重要生物学特性之一。对Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达、功能及其可调性的分子机制的研究对胃癌的早期诊断和预后判断及基因等方面具有重要意义。
【】
［１］Ｎａｇａｔａ Ｓ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｐ．Ｔｈｅ Ｆａｓ ｄｅａｔｈ ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２６７：１４４９－１４５６．
［２］Ｃａｓｃｉｎｏ Ｉ，Ｆｉｎｃｃｉ Ｇ，Ｐａｐｏｆｆ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｅｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｆａｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９５，１５４：２７０６－２７１３．
［３］ＬＩ Ｈ，Ｈａｍｏｕ ＭＦ，ｄｅ Ｔｒｉｂｏｌｅｔ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｒｉａｎｔ ＣＤ４４ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３，５３：５３４５－５３４９．
［４］岩，刘宁，刘佳，等．冰冻组织特定区域的ＲＮＡ快速提取及其ＲＴ?ＰＣＲ分析［Ｊ］．中华医学遗传学杂志，２０００，１７（１）：４７－５０．
［５］王成龙，谭家麟．胃癌发生发展中Ｆａｓ，ＦａｓＬ和Ｂｃｌ?２的表达［Ｊ］．肿瘤，２００１，１０（１）：４６－４７．
［６］李昭辉，王占民，赵志伦，等．Ｆａｓ，Ｆａｓ配体和ＩＮＦ?γ在胃癌中的表达［Ｊ］．北京大学学报（医学版），２００３，３５（４）：３８６－３８８．
［７］Ｍｉｄｉｓ ＧＰ，Ｓｈｅｎ Ｙ，Ｏｗｅｎ?Ｓｃｈａｕｂ ＬＢ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｆａｓ（ｓＦａｓ）ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９６，５６：３８７０－３８７４．
