猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定
作者：李孟彬，王为忠，张宏伟，管文贤，张溪
［摘要］ 目的： 原代培养猪血管内皮细胞并纯化和成功传代.方法: 自乳猪活体状态下获取腹主动脉，以胶原酶消化、培养PAEC，观察细胞形态、贴壁率，以DiIAcLDL吸收试验进行细胞类型的鉴定.结果: 原代PAEC贴壁率约90%，培养至第2代即可获得纯化的PAEC，第5代至第12代细胞增殖较快，形态正常，呈圆形、短梭形和三角形，DiIAcLDL吸收试验阳性.结论: 通过活体状态下获取血管、控制杂细胞污染的途径以及合理选择酶消化法可以有效快捷地获得纯化的PAEC并稳定传代.1材料和方法
1.1材料
乳猪（体质量8 kg）由第四军医大学西京实验动物中心提供，Ⅰ型胶原酶（Sigma），胰蛋白酶，DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），DiIAcLDL（美国Cell Applications公司），一次性培养瓶（Nunc），荧光显微镜等.
1.2方法
以氯胺酮80 mg/kgim麻醉，入腹后自左侧髂总动脉向心侧插入大隐静脉导管，注射肝素500 U，从髂总血管根部向上游离腹主动脉至主动脉弓下方，结扎切断各分支；剪开右髂总动脉根部灌洗至流出液清亮后，于髂总动脉根部、主动脉弓下方结扎切断，放于4℃含肝素抗生素盐水（肝素100 ku/L，青霉素40 Mu/L）内运至细胞培养室；在750 mL/L乙醇内浸泡5 min后移入超净台，剪去血管两端，以4℃含肝素抗生素盐水冲洗管腔和外膜后，注入37℃预热的10 g/L胶原酶至另一端处可见灌入液为止，以无创血管夹夹闭两端，置于37℃无菌肝素抗生素盐水内；5 min后剪去一端收集消化液，并以Hanks液冲洗，均加入离心管，以1000 r/min离心5 min，收集细胞以含青霉素50 ku/L、链霉素10 mg/L的DMEM完全培养液接种于25 cm2培养瓶内，CO2孵箱内培养，3 h后换液，以后每3 d换液1次，细胞长满后传代.以Hanks液2 mL冲洗细胞2遍，25 cm2培养瓶中加入2.5 g/L胰蛋白酶溶液1 mL，在显微镜下观察细胞开始收缩变圆，即去除消化酶，显微镜下细胞开始分离时加入完全培养液，吹打成单细胞悬液，按1∶2传代接种.第3代后培养液内不加抗生素.在相差显微镜下观察活细胞的形态.DiIAcLDL吸收试验参照Voyta的方法［1］ ，将PAEC接种于盖玻片上，铺满后去除培养液并以37℃培养液洗1次.在弱光环境下，每孔加入DMEM完全培养液200 μL及DiIAcLDL液10 μL，使DiIAcLDL浓度为10 mg/L，孵育4 h后以PBS液冲洗盖玻片3遍，加1滴DABCO封固液，扣于载玻片上，指甲油密封周边.24 h内在荧光显微镜下观察.
2结果
猪主动脉从阻断血流至接种到培养液内时间约30 min.3 h后细胞贴壁率为90%左右，混杂有少许血细胞，未见明显纤维细胞和平滑肌细胞的污染，第2代时混杂血细胞消失.在相差显微镜下，PAEC接种后3 h可见细胞呈圆形、三角形或短梭形，伪足2~3个，并逐渐形成细胞集落.原代细胞培养4 d、传代细胞培养2~3 d后，生长迅速，细胞较大，有2~3个明显增大的椭圆形细胞核，细胞铺满后呈典型的铺路石样.原代PAEC生长相对较慢，约8 d铺满25 mm2培养瓶.第4代以后生长较快，根据接种密度不同细胞铺满培养瓶约5~7 d，对数生长期在接种后2~5 d.DiIAcLDL吸收试验阳性，在荧光显微镜下以552 nm波长激发光作用，胞质内发出鲜艳的红色荧光.
3讨论
PAEC原代培养常有血细胞、纤维细胞和平滑肌细胞污染.血细胞贴壁能力较弱，可以在培养液内加入肝素并于细胞接种3 h后换液予以清除［1］ .我们在活体状态下取材，血液肝素化、靠近根部结扎血管、离断血管前肝素盐水灌洗，使血细胞得以最大限度清除；避免过分钳夹血管及注入过量胶原酶使血管过度膨胀，消化时将血管置于37℃无菌Hanks液内，仔细冲洗血管两端或剪除取材一端后收集细胞，以及在细胞接种3h后即行换液等措施，均有助于防止纤维细胞、平滑肌细胞污染.选择10 g/L胶原酶37℃消化5 min可获取足量的PAEC.灌注消化酶时尽量排出血管内气体，收集细胞时先轻轻揉搓血管促使内皮细胞脱落，可提高细胞采集的效率.人血管内皮细胞可以检测第Ⅷ因子相关抗原、WeibelPalade小体等进行鉴定［2］ ，但PAEC没有Ⅷ因子相关抗原和WeibelPalade小体［1］ ，根据PAEC表面受体能够吞噬吸收低密度脂蛋白（LDL），且比血管平滑肌细胞、纤维细胞要强7~15倍的特点，多采用DiIAcLDL吸收试验进行鉴定 ［3］ .
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［1］Man GT, Feng ZH, Zhang TL, et al. Improvement in the techniques of culturing and purifying pig, human, and rat endothelial cells and smooth muscle cells［J］ . Chin J Histochem Cytochem, 2001; 10(2): 128-123.
［2］Li XD, Lu KHa, Guo SZ, et al. Culture of vascular endothelial cell［J］ . Chin J Aesthetic Med, 2001; 10(3): 18-20.
［3］Carrillo A, Chamorro S, RodriguezGago M, et al. Isolation and characterization of immortalized porcine aortic endothelial cell lines［J］ . Vet Immunol Immunopathol, 2002 ;89(12):91-98.
