AngⅡ对人心房肌细胞膜钾通道电流的影响及替米沙坦的拮抗作用

            作者：张殿新，黄岚，王海昌，张荣庆，程何祥，刘兵，张清，郭文怡

【关键词】  膜片钳术

　　【Abstract】AIM：  To observe the effects of angiotensin Ⅱ (AngⅡ) on potassium currents of human atrial myocytes so as to reveal the mechanisms of atrial arrhythmia induced by AngⅡ, and to provide a laboratory basis for the application of angiotensin Ⅱ receptor antagonist in the treatment of atrial arrhythmias. METHODS:  Single human atrial myocyte was isolated and the conventional wholecell configuration of patchclamp technique was used to detect membrane Ik1 and Ito. The experiment was conducted in four groups: control group, AngⅡ group, telmisartan group, and AngⅡ + telmisartan group. RESULTS:  Compared with the control group, AngⅡ of 0.1 μmol/L significantly decreased the peak density of Ito in human atrial myocytes (pA/pF,6.55±0.52 vs 12.65±1.06 ,  P<0.01). Under the voltage of -100 mV, AngⅡ significantly increased the peak density of IK1 (pA/pF, -9.31±1.02 vs -5.23±0.98 , P<0.01). Telmisartan of 0.01 μmol/L had no significant effect on Ik1 and Ito in human atrial myocytes, but it antagonized the effects of AngⅡ. In AngⅡ + telmisartan group, the peak density of Ito (pA/pF, 11.74±1.28)  and the peak density of IK1 ( pA/pF, -6.13±1.15)  were both significantly different with those in AngⅡ group（P< 0.01）. CONCLUSION: AngⅡ has significant electrophysiological effects on human atrial myocytes. AngⅡ of 0.1 μmol/L significantly increases the peak density of IK1, but decreases the peak density of Ito in human atrial myocytes. Telmisartan antagonizes the effects of AngⅡ on human atrial myocytes.

　　【Keywords】  telmisartan; potassium channels; patch clamp techrieques; heart atria; muscle cells; angiotensinⅡ

　　【摘要】目的： 观察AngⅡ对人心房肌细胞膜钾电流的作用，揭示其参与房性心律失常的电生理机制，为应用AngⅡ受体拮抗剂房性心律失常提供实验基础.方法： 急性分离单个人心房肌细胞，采用全细胞膜片钳方法记录内向整流钾电流(Ik1)、短暂外向钾电流（Ito）.实验分4组：对照组，AngⅡ（01 μmol/L）组，替米沙坦（001 μmol/L）组，AngⅡ+替米沙坦组.结果： 与对照组相比，01 μmol/L AngⅡ使人心房肌细胞膜Ito峰值电流密度明显下降(pA/pF, 655±052 vs 1265±106，P＜001）, 在-100ｍＶ电压下使IK1 峰值电流密度显著升高 (pA/pF, -931±102 vs -523±098, P<001).0.01 μmol/L替米沙坦对人心房肌细胞膜Ito IK1无明显影响，但可拮抗AngII的作用；AngⅡ+替米沙坦组的Ito峰值电流密度 (pA/pF,1174±128 )和IK1 峰值电流密度(pA/pF, -613±115) 与AngⅡ组相比有显著差别（P＜001）.结论： AngⅡ对人心房肌细胞具有明显的电生作用，01 μmol/L AngⅡ可促进人心房肌细胞膜IK1并抑制Ito，替米沙坦可拮抗AngⅡ对人心房肌细胞膜钾电流的作用.

　　【关键词】 替米沙坦; 钾通道；膜片钳术；心房；肌细胞；血管紧张素Ⅱ

　　0引言

　　血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）是肾素血管紧张素系统中的主要活性肽产物，与许多心血管疾病密切相关.近年来发现血管紧张素转换酶抑制剂具有防治房颤的作用，AngⅡ在心律失常发生中的作用受到关注［1,2］.研究证实AngⅡ不仅可引起室性心律失常，且对心房电重构有促进作用，有利于心房颤动的发生与维持，而AngⅡ受体拮抗剂可抑制心房电重构［3,4］.本实验旨在通过研究AngⅡ对人单个心房肌细胞钾离子流的作用，了解其诱发房性心律失常可能的电生理学机制；并观察替米沙坦（telmisartan）的拮抗作用，为应用AngII 受体拮抗剂治疗房性心律失常提供实验基础.

　　1材料和方法

　　11材料

　　111对象200306/200406西京接受心脏体外循环手术的先天性心脏病患者10（男6，女4）例；平均年龄(148±56)岁.患者皆无持续性房颤病史，无严重左室功能不全，2 wk未使用过血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂或血管紧张素转换酶抑制剂.建立体外循环前取右心耳组织，放入氧饱和的4℃心脏停搏液中，5 min内送回实验室.

　　112溶液成分和试剂① 正常Tyrode氏液组成为（mmol/L）： NaCl 126、KCl 54、MgCl2 08、CaCl2 1、NaH2PO4 033、Glucose 55、HEPES 10，用NaOH调pH至74.② 无钙Tyrode氏液为上述正常Tyrode氏液中不含CaCl2.③ KB液的组成为(mmol/L)： 谷氨酸 70、KCl   0、牛磺酸10、KH2PO4 10、EGTA 10、Glucose 10、用KOH调pH至74.④ 记录钾通道电流的电极内液(mmol/L)：KCl 140、MgCl2 05、HEPES 10、EGTA 10、Na2ATP 5.pH用KOH校至72.电极外液： NaCl 135、KCl 54、CaCl2 1、MgCl2 2、HEPES 5、Glucose 15，pH用NaOH校至74.⑤ AngⅡ和替米沙坦的配制： AngⅡ以1 mmol/L浓度溶于双蒸馏水中，分装后-20℃保存，实验时以分装液溶于细胞外液而得到01 μmol/L终浓度.替米沙坦结晶粉末几乎不溶于水和pH39的水溶液.溶液配置方法： 称取替米沙坦52 mg，加入60 mL DMEM培养基中；用1mol/L NaOH调pH至95,搅拌至药物完全溶解；再加DMEM培养液至溶液总量为100 mL；用1 mol/L HCl调pH至74备用.替米沙坦配制浓度为01 mmol/L，实验时终浓度为001 μmol/L.实验所用AngⅡ、胶原酶、蛋白酶、EGTA、HEPES、TTX、CdCl2、4AP为美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，替米沙坦为江苏天士力帝益药业有限公司赠送，其余为国产分析纯.

　　12方法

　　121单个人心房肌细胞的分离根据我科实验室的方法进行［5］.人右心耳标本在氧饱和无钙台氏液中剪成约01 mm×01 mm×01 mm的组织块，洗涤；在37℃、磁力搅拌及充氧条件下，用含胶原酶（333 mkat/L）、蛋白酶（3334 μkat/L）的无钙台氏液消化15 min后，换为含胶原酶333 mkat/L的无钙台氏液进一步消化；5~10 min后将组织块在KB液中轻轻吹打，细胞悬液用200目滤网过滤；细胞在KB液中保存60 min后进行电生理记录.

　　122实验分组实验分4组： 对照组；AngⅡ 组：以含AngⅡ01 μmol/L的电极外液灌流；替米沙坦组： 以含替米沙坦001 μmol/L的电极外液灌流；AngⅡ +替米沙坦组：电极外液先加替米沙坦001 μmol/L，2 min后再加AngⅡ01 μmol/L.各组皆采用全细胞膜片钳方法记录内向整流钾电流(Ik1)和短暂外向钾电流（Ito）.

　　123膜片钳全细胞记录取细胞悬液1～2滴，转入倒置显微镜上的自制灌流槽中，室温下静置5～10 min，使细胞充分贴壁；以正常含钙10～20 mmol/L的台氏液进行灌流，速度为10 mL/min.采用两步拉制法拉制微电极，冲灌电极内液后阻抗4～8 MΩ，将电极固定在电极夹持器上与Axon200Ｂ放大器相连，在倒置显微镜下找到边界清楚、纹理清晰、大小适中的细胞；迅速将电极靠近细胞，在液接电位补偿后利用负压抽吸，使形成高阻抗封接；快电容补偿后破膜，慢电容补偿后即可对细胞进行电压钳制，建立全细胞记录模式.刺激脉冲通过pClamp80软件控制的Ｄ/Ａ转换器操纵，记录的信号经膜片钳放大器(Axon200B) A/D转换及2 KHz滤波放大后存入机硬盘.记录心肌细胞Ito和IK1及每个细胞电容,计算电流密度(pA/pF)=电流(pA)/电容(pF).

　　Ito的测定：HP50 mV，脉宽400 ms，从-30 mV至＋70 mV，阶跃20 mV.IK1的测定： 钳制细胞膜于-40 mV，使细胞膜分别去极化至0～-140 mV，刺激持续时间为300 ms，IK1为每一刺激未期稳态电流的测定值.IK1测定过程中，电压依赖型钠通道由细胞外液中的TTX 20 μmol/L所阻断，电压依赖型钙通道由细胞外液中的CdCl2（300 μmol/L）所阻断，Ito由细胞外液中的4AP（5 mmol/L）所阻断.

　　统计学处理: 采用pClamp80 for Windows及Clampex80软件测量电流.实验重复5次，数据以x±s 表示.采用SPSS软件进行2×2析因设计方差分析，Ｐ<001为差异有非常显著的统计学意义.

　　2结果

　　21AngⅡ和替米沙坦对Ito的作用AngⅡ与替米沙坦对人心房肌细胞Ito峰值电流密度有交互效应（P＜001）, 01 μmol/L的AngⅡ 使Ito峰值电流密度明显下降(与对照组相比P＜001). 001 μmol/L替米沙坦对Ito无显著影响，但可拮抗AngⅡ的作用，使Ito峰值电流密度下降程度减轻(Tab 1,Fig 1).

　　22AngⅡ和替米沙坦对内向整流钾电流（IK1）的作用将钳制电位置于-40 ｍＶ,给予-100～30 ｍＶ、阶跃10 ｍＶ、持续300 ｍｓ的指令电压,得到1组稳态电流值,且不随时间而改变；当钳位电压>- 60 mV（反转电位）时,钾电流外向,但外向电流不随钳位电压升高而加大,表现为内向整流特性（即IK1）.

　　AngⅡ与替米沙坦对人心房肌细胞Ito峰值电流密度有交互效应（P＜001）,在01 μmol/L Ang Ⅱ作用下IK1 幅值升高，在-100 ｍＶ电压下IK1电流密度由(-523±095) pA/pF升至(-931±102) pA/pF (P＜001).但整流特性、反转电位未变,提示内向钾离子流加大.001 μmol/L替米沙坦对IK1无显著影响，但可拮抗AngⅡ的作用，使IK1峰值电流密度上升程度减轻(Tab 1, Fig 2).表1AngⅡ和替米沙坦对人心房肌细胞Ito和IK1峰值电流密度的影响（略）

　　3讨论

　　心房纤颤是临床最常见的复杂心律失常之一，近年发现心房电重构（Atrial electrical remodeling）在房颤的发生、持续及房颤引起的一系列心房功能改变中起着重要作用.心房电重构包括快速的功能性改变以及离子通道基因表达的缓慢变化，其重要的离子基础是心房肌细胞ICa-L和Ito密度显著降低,超极化状态下IK1密度增加［6］.研究发现，AngⅡ是心房电重构的一个重要参与因素.血管紧张素转换酶抑制剂并非传统意义上的抗心律失常药，但可减少心肌梗死后房颤的发生［1］.一项前瞻性随机临床研究报道，在慢性持续性房颤患者复律后合用伊贝沙坦与胺碘酮，比单用胺碘酮显示出更好的维持窦律效果［7］.血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物具有抗心律失常作用，可能为临床上房颤的药物提供新的治疗观念和途径.近来发现AngⅡ可诱发加重心房电重构，而血管紧张素转换酶抑制剂（如卡托普利）及AngⅡ受体拮抗剂如坎地沙坦可阻止或减轻心房电重构的发生［3］.临床研究证实房颤患者心房血管紧张素转换酶表达增加，并且伴有心房血管紧张素Ⅱ1型（AT1）受体下调和AT2受体蛋白显著上调；局部AngⅡ浓度增高可能引起心房纤维化，构成房颤发生和维持的基础［4］.吴书林等发现缬沙坦对房颤患者心房肌细胞离子电流表现出异于窦律患者的作用,可能有利于改善房颤导致的心房电重塑［8］.但关于AngⅡ如何参与心房电重构尚不清楚，研究AngⅡ及AngⅡ受体拮抗剂对人心房肌细胞的直接电生理作用可能有助于揭示其机制.

　　我们研究发现，AngII对人心房肌细胞具有明显的电生作用，01 μmol/L AngⅡ可促进人心房肌细胞膜IK1并抑制Ito.IK1为背景钾电流，属电压依赖性钾通道，是决定工作心肌细胞膜静息电位及动作电位3相快速复极化过程的主要离子电流［9］；房颤患者心房肌细胞静息膜电位可能因IK1重塑而处于更负电位水平；房颤患者的IK1有增加的趋势，其机制可能代偿高频除极.瞬间外向钾电流（Ito）组成动作电位1相，其电流密度在人体心房大于心室［10］，房颤及快速心房起搏时Ito降低.本研究发现，AngⅡ可促进人心房肌细胞膜IK1而抑制人心房肌细胞膜Ito，这表明AngⅡ可通过对钾电流的影响而直接参与心房电重构的发生.替米沙坦是非肽类新型AngⅡ 受体拮抗剂，可选择性地、难以逆转地阻滞心血管系统AngⅡ 的1型受体（AT1受体）［11］，临床上主要用于抗高血压治疗，其对心律失常（如心房纤颤）可能的防治作用也已引起关注［12］.本研究发现替米沙坦可拮抗AngⅡ对人心房肌细胞膜钾电流的作用，这为应用AngⅡ受体拮抗剂治疗房性心律失常提供了实验基础.

　　AngⅡ对人心房肌细胞具有促进人心房肌细胞膜IK1并抑制Ito的电生理学作用，可能因而参与人类心房电重构及心房纤颤的发生；AngⅡ受体拮抗剂替米沙坦可拮抗AngⅡ对人心房肌细胞膜钾电流的作用，有可能对房性心律失常具有防治作用.

　　【】

　　［1］ Pedersen OD, Bagger H, Kober L,et al. Trandolapril reduces the incidence of atrial fibrillation after acute myocardial infarction in patients with left ventricular dysfunction［J］. Circulation,1999; 100(4):376-380.

　　［2］ Li D, Shinagawa K, Pang L, et al. Effects of angiotensinconverting enzyme inhibition on the development of the atrial fibrillation substrate in dogs with ventricular tachypacinginduced congestive heart failure［J］. Circulation, 2001;104(21):2608-2614.

　　［3］ Kumagai K, Nakashima H, Urata H, et al. Effects of angiotensin II type 1 receptor antagonist on electrical and structural remodeling in atrial fibrillation［J］. J Am Coll Cardiol, 2003;41(12):2197-2204.

　　［4］ Boldt A, Wetzel U, Weigl J, et al. Expression of angiotensin II receptors in human left and right atrial tissue in atrial fibrillation with and without underlying mitral valve disease［J］. J Am Coll Cardiol,  2003; 42(10): 1785-1792.

　　［5］ 张荣庆，梁延春，周更须，等.国人单个心房肌细胞的分离及活性鉴定［J］.第四军医大学学报,2001；22（2）：188-190.

　　Zhang RQ,Liang YC,Zhou GX， et al. Isolation and viability identification of human single atrial myocyte［J］.J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(2):188-190.

　　［6］ Bosch RF, Zeng X, Grammer JB,et al. Ionic mechanisms of electrical remodeling in human atrial fibrillation［J］. Cardiovasc Res,1999;44(1):121-131.

　　［7］ Madrid AH, Bueno MG, Rebollo JM,et al. Use of irbesartan to maintain sinus rhythm in patients with longlasting persistent atrial fibrillation: A prospective and randomized study［J］.Circulation, 2002;106(3):331-336.

　　［8］ 吴书林，薛玉梅，钱卫民，等.心房颤动患者心房肌细胞离子重塑及缬沙坦的干预研究［J］.中华心血管病杂志,2004；32（3）：197-201.

　　Wu SL,Xue YM,Qian WM, et al.The ionic remodeling and the effects of valsartan on ionic currents in human atrial myocytes from patients with chronic atrial fibrillation［J］. Chin J Cardial, 2004;32(3):197-201.

　　［9］ 杨向军，蒋文平.Ang Ⅱ受体对内向整流性钾流的影响［J］.苏州医学院学报,2000 ;20 (4)：314-317.

　　Yang XJ,Jiang WP.The effects of angiotension II receptors on inward rectifier potassium current［J］. Acta  Acad Med Suzhou, 2000;20(4):314-317.

　　［10］ Caballero R, Gomez R, Moreno I, et al. Interaction of angiotensin II with the angiotensin type 2 receptor inhibits the cardiac transient outward potassium current［J］. Cardiovasc Res, 2004;62(1):86-95.

　　［11］ Maillard MP,Perregaux C,Centeno C,et al. In vitro and in vivo characterization of the activity of telmisartan: An insurmountable angiotensin Ⅱ receptor antagonist［J］. Pharmacology, 2002; 302(3): 1089-1095.

　　［12］ Unger T.The ongoing telmisartan alone and in combination with ramipril global endpoint trial program［J］. Am J Cardiol, 2003;91(10A):28-34