Toll样受体4 siRNA 表达载体的构建及其在体外对RAW264.7细胞TLR4的抑制效果

         作者：徐哲，黄长形，李羽，王平忠，任广立，张岩，刘清泉，贾战生，聂青和，孙永涛，白雪帆

【摘要】  　　目的： 构建针对小鼠Toll样受体4(TLR4)的小干扰RNA(siRNA)表达载体，体外评价对RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白水平的抑制效果；观察对TNF?α， MIP?2水平及p38?MAPK， ERK1/2磷酸化水平的影响. 方法： 根据siRNA设计原则并经BLAST比对，设计合成7条siRNA双链复合体，体外退火后在T4连接酶作用下连接入重组载体pSilencerTM 4.1?CMV neo plasmid，连接产物转化JM l09感受态细胞，筛选阳性克隆并提取重组体，行HindⅢ及BamHⅠ双酶切，酶切产物经聚丙稀酰胺凝胶电泳确定插入片段，测序鉴定；RT?PCR检测TLR4 mRNA水平变化，间接免疫荧光及Western Blot检测TLR4蛋白水平变化；用LPS刺激转染细胞，观察TNF?α及MIP?2水平的变化，Western Blot检测p38?MAPK及ERK1/2磷酸化水平的变化. 结果： 双酶切及测序证实重组载体构建成功；体外实验表明，RAW264.7细胞中TLR4 mRNA及蛋白水平均降低；TLR4 siRNA抑制LPS对TNF?α及MIP?2表达的上调作用，LPS对p38?MAPK及ERK1/2的活化作用亦被TLR4 siRNA下调. 结论： TLR4 siRNA表达载体在体外可下调RAW264.7细胞的TLR4表达，抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF?α及MIP?2的分泌有抑制作用，TLR4 siRNA可望作为调控LPS信号通路的一个有效工具.

【关键词】  Toll样受体4；RNA，小分子干扰；脂多糖类；巨噬细胞

　    【Abstract】 AIM: To construct siRNA expression vectors targeting the gene of mouse Toll?like receptor 4(TLR4),   to evaluate the inhibition effects of TLR4 siRNA on the mRNA expression and protein level of TLR4 in RAW264.7 cells in vitro and to observe  the changes of TNF?α and MIP?2 levels and the phosphorylation levels of p38?MAPK and ERK 1/2.  METHODS: According to the siRNA design principles and screening by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), we designed and synthesized 7 pairs of siRNA duplex targeting TLR4. The siRNA duplex were ligated into the recombinant vector pSilencerTM 4.1?CMV neo plasmid, then the ligation products were transformed into competent cells of E.coli JM109 and then recombinant colonies were selected. The positive colonies were picked for double restriction enzyme digestion with HindⅢ and BamHⅠ  and sequencing, and the restriction digest products were separated by SDS?PAGE to confirm the insert size. We determined the changes of TLR4 mRNA levels by RT?PCR and evaluated the protein levels of TLR4 by indirect immunofluorescence assay  and Western Blot. Furthermore, we stimulated the transfected cells with LPS and examined the changes of TNF?α and MIP?2, and detected the phosphorylation levels of p38?MAPK and ERK 1/2 by Western Blot.  RESULTS: The recombinant vectors were successfully constructed as confirmed by enzyme digestion and sequencing. The in vitro experiment indicated that TLR4 siRNA markedly down?regulated the TLR4 mRNA and protein levels in RAW264.7 cells. Treatment with TLR4 siRNA significantly decreased the rising  amplitude of TNF?α and MIP?2 caused by LPS. TLR4 siRNA treatment also down?regulated the phosphorylation levels of p38?MAPK and ERK 1/2 activiated by LPS.  CONCLUSION:  TLR4 siRNA expression vectors markedly down?regulate TLR4 expression and inhibit the MAPK signaling pathway in RAW264.7 cells in vitro, and significantly reduce the production of TNF?α and MIP?2 evoked by LPS. TLR4 siRNA may be a potential tool in the modulation of the LPS signaling pathway.

    【Keywords】 Toll?Like Receptor 4; RNA, small interfering; Lipopolysaccharides; Macrophages

　　 0引言

    由肠源性内毒素血症诱发的、以TNF?α为核心的细胞因子所致的介质病（mediator disease），在肝功能衰竭的发病机制中起到非常重要的作用. Toll样受体4(toll?like  receptor 4, TLR4)是近年来发现的对LPS应答的主要受体，TLR4表达量或位置的异常与急性肝功能衰竭等疾病的发病有关［1-4］. TLR4是巨噬细胞中LPS信号转导的限速因子，通过改变TLR4的结构和表达或可调控LPS信号通路. 本实验我们构建了针对小鼠TLR4的小干扰RNA(siRNA)表达载体，进行酶切及测序鉴定，体外评估其对TLR4 mRNA、蛋白表达水平的抑制作用，旨在评价TLR4 siRNA对TNF?α， MIP?2水平的影响及对LPS诱导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的作用.

    1材料和方法

    1.1材料siRNA表达质粒pSilencerTM 4.1?CMV neo购自美国Ambion公司，为氨苄抗性新霉素筛选线性载体，两端酶切位点为HindⅢ， BamHⅠ. 7条siRNA双链复合体均由上海Invitrogen公司合成. 阴性对照siRNA (p?NC)由美国Ambion公司提供，其所携带的siRNA序列与小鼠、人、大鼠基因组均无同源性.

    采用本室保存JM l09菌制备感受态细胞，TLR4引物，上游： 5′?TTTATTCAGAGCCGTTGG?3′, 下游：5′?GGCTATCTGTGAGCGTGT?3′; TNF?α引物，上游：5′?ATGAGCACAGAAAGCATGATC?3′, 下游：5′?TACAGGCTTGTCACTCGAATT?3′; MIP?2引物，上游：5′?GAACAAAGGCAAGGCTAACTGA?3′, 下游：5′?AACATAACAACATCTGGGCAAT?3′; GAPDH引物, 上游：5′?AACGACCCCTTCATTGAC?3′, 下游： 5′?TCCACGACATACTCAGCAC?3′，各引物由上海Invitrogen公司合成.鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞（上海午立公司）；siPort?XP1（美国Ambion公司）.

    1.2方法

    1.2.1siRNA靶向序列设计将基因库收录的小鼠TLR4基因全序列(NM_021297)作为靶向分子，采用美国Ambion公司在线设计工具，根据siRNA的一般设计原则及研究者经验，选择起始密码子100 nt后，G/C含量在30%~52%，基本无内部重复序列，设计合成了7条21 nt的特异性siRNA双链复合体，两端酶切位点分别为HindⅢ和BamHⅠ，并在线与基因库小鼠来源的基因序列进行BLAST比对，选择同源性小的7对序列送公司合成.

    根据评分原则［5］评分，此7对siRNA得分均在6分以上，相应合成的DNA各链均含酶切位点和颈环，每条单链为55 bp.

    1.2.2载体构建常规氯化钙法制备JM 109感受态Ecoli，将合成的55 bp正、负链退火，所获siRNA双链复合体用T4 DNA连接酶连接入载体pSilencerTM 4.1?CMV neo，克隆转化，挑单克隆菌落过夜摇菌，常规小提质粒，紫外分光光度计测量A260 nm/A280 nm，估算其浓度及有无蛋白核酸污染. 所提质粒行HindⅢ, BamHⅠ双酶切，酶切产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶染色，凝胶成像系统观测结果并照相. 全部载体行测序鉴定.

    1.2.3细胞培养和转染RAW264.7细胞在含100 mL/L胎牛血清、抗生素、谷氨酰胺的RPMI?1640 (Hyclone, Logan, Utah)培养基中，37℃  50 mL/L CO2培养，每隔2～3 d传代1次，实验选用对数生长期细胞.

    转染用试剂为siPort?XP1，按照说明书步骤进行. 设立两个对照组：正常对照组（未行转染的正常RAW264.7细胞组）和p?NC转染对照组. 

    1.2.4RT?PCR采用Trizol提取RAW264.7细胞(1×106)RNA，RT?PCR用一步法试剂盒进行，50 μL PCR反应体系：25 μL  2×反应混合液，5 μL模板RNA，上游引物及下游引物各1 μL，2 μL SuperScript III/Platinum Taq Mix, 0.5 μL RNA酶抑制剂，15.5 μL DEPC处理水. 整个反应在MyCycler thermal cycler (Bio?Rad, USA)上进行，GAPDH为内参照. 扩增参数：58℃  30 min, 94℃ 2 min, 1个循环；94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 1 min，25个循环；68℃ 5 min. DL2000确定PCR产物大小，12 g/L琼脂糖凝胶电泳，置凝胶成像系统成像，UVP LabWork 4.0软件进行半定量分析.

    1.2.5间接免疫荧光及激光共聚焦在盖玻片上培养RAW264.7细胞，PBS洗涤，风干，丙酮4℃固定15 min, 用含5 mL/L Triton X?100的PBS室温下洗涤15 min，含50 g/L脱脂乳的FBS  37℃封闭30 min. 羊抗鼠TLR4多克隆抗体(Santa Cruz, CA, 稀释度1∶50)37℃孵育1 h后，设不加一抗组为空白对照，用PBS洗涤细胞3次，每次5 min，然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的驴抗羊IgG (Santa Cruz, CA, 稀释度1∶100) 37℃孵育1 h. PBS洗涤细胞3次，每次5 min，500 g/L 缓冲甘油封片，BX51荧光显微镜(Olympus, Japan)观察荧光并照相.  激光共聚焦采用Bio?Rad (Hercules, CA) MRC 1024共聚焦显微镜进行，Image Pro 3DS 6.0软件分析图像.

    1.2.6蛋白印迹(Western Blot)6孔板中每孔细胞用200 μL三裂解液裂解细胞，12 000 g, 4℃离心5 min，收集上清，-80℃保存备用. Analytik Jena Specord 40 分光光度计测定蛋白浓度. 每样本取10 μg总蛋白加入上样缓冲液，沸水煮5 min，10 mL/L的SDS?PAGE胶电泳，电转至硝酸纤维素膜. 含50 g/L脱脂乳的TBST封闭1 h，TBST洗膜3次，一抗4℃孵育过夜，然后加入辣根过氧化氢酶标记的Cruz MarkerTM compatible二抗孵育1 h，ECL显色试剂盒显色，暗室中压片. 蛋白分子量标定采用Cruz MarkerTM蛋白分子量标准. GAPDH为内参照物.

    1.2.7ELISA检测RAW264.7细胞以1×108/L密度接种于24孔板. 为评估TLR4 siRNA对TNF?a和MIP?2分泌水平的影响，RAW264.7细胞在LPS(1 mg/L)刺激24 h前行siRNA转染. LPS刺激后6 h，收集培养上清，-70℃冻存、备用. ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)检测TNF?α和MIP?2的浓度. MIP?2和TNF?a的检测下限分别为1.5和5.1  μg/L.

    统计学处理： 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料以x±s表示，两组比较采用Mann?Whitney 检验， 多组间比较用Kruskal?Wallis检验，P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1载体构建、克隆转化、酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳及测序双酶切产物经150 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后（图1），可见在50～60 bp间有清晰条带出现. 测序结果与合成片段序列完全符合.

    M1: 50 bp DNA分子量标准; 1: p?NC; 2: TS1; 3: TS2; 4: TS3; 5: TS4; 6: TS5; 7: TS6; 8: TS7; M2: 20 bp DNA分子量标准.

    图1所构建TLR4 siRNA载体之HindⅢ, BamHⅠ双酶切聚丙烯酰胺凝胶电泳

    2.2TLR4 siRNA特异性沉默TLR4 mRNA表达TLR4 RT?PCR反应获得单一条带(816 bp)，测序证实为TLR4之特异条带.

    转染后24 h，RT?PCR检测TLR4 mRNA表达结果表明，TLR4 siRNA对TLR4 mRNA的抑制作用有效、特异并呈剂量依赖性，而阴性对照siRNA (p?NC) 对TLR4 mRNA表达无影响. TS4转染组TLR4/GAPDH比值为（0.0165±0.0040），与阴性对照p?NC组(0.3300±0.0800)比较，差异具有统计学意义(n=3,P<0.05,图2).

    M: DNA分子量标准; 1: 正常对照组; 2: p?NC组; 3: TS1转染组; 4: TS2转染组; 5: TS3转染组; 6: TS4转染组; 7: TS5转染组; 8: TS6转染组; 9: TS7转染组.

    图2siRNA转染后24 h RAW264.7细胞TLR4 mRNA表达RT?PCR

    转染后24 h  TLR4 RT?PCR结果，在TS4转染组，抑制效果最好，抑制率达95%. 在TS6及TS7转染组，TLR4/GAPDH为（0.0330±0.0076），（0.0495±0.0058），抑制率分别为90%及85%. 在TS1，TS2，TS3及TS5转染组，TLR4 mRNA抑制率不超过50%. 而在正常对照组及p?NC组，TLR4 mRNA水平无明显变化.

    　　在瞬时转染组，基因沉默在转染后第3日达到最高水平，有3组特异性siRNA对TLR4的基因沉默效果可维持至转染后第9日. 在稳定转染组，siRNA的抑制效果持续且稳定. 这些结果提示TLR4 mRNA在RAW264.7细胞中的表达可被有效抑制.

    2.3TLR4 siRNA下调TLR4在RAW264.7细胞上的表达间接免疫荧光结果显示（图3），转染后24 h，平均荧光强度与正常对照组(197.9±24.5)相比，转染细胞的绿色荧光强度在TS2转染组(87.9±10.2)， TS4转染组(2.6±0.5)， TS6转染组(29.1±5.2)及TS7转染组(34.3±5.8)均下降50％以上. 抑制率TS2转染组为55.6%，TS6转染组为85.3%，TS4转染组抑制效率高达98.7%.

    激光共聚焦显示（图4)，TLR4 siRNA下调RAW264.7细胞表面TLR4表达，转染后14 d，TS4，TS6及TS7转染组的平均荧光强度分别为(10.8±3.2)，(28.7±6.1)和(54.6±7.4)，与p?NC组(185.3±18.6)及正常对照组(164.6±19.0)相比,差异均有统计学意义(n=3,P<0.05).

    转染后24 h TLR4之蛋白印迹结果示（图5），在TS4转染组，TLR4表达被抑制至背景水平(TLR4/GAPDH）：TS4转染组（0.0018±0.0004）， 正常对照组（0.8135±0.1970). TLR4/GAPDH在TS6及TS7转染组为(0.0976±0.0256)，(0.1627±0.0300)，抑制效果分别为88%及80%. TS2转染组(0.4067±0.0841)抑制效果为50%， TS3转染组(0.5857±0.1250)及TS5转染组(0.4881±0.0978)，抑制效果分别为28%及40%. TS1转染组(0.7164±0.1362)对TLR4的表达无抑制作用.

    A: 空白对照组; B: 正常对照组; C: p?NC组; D: TS1转染组; E: TS2转染组; F: TS4转染组; G: TS6转染组; H: TS7转染组.

    图3siRNA转染后24 h TLR4间接免疫荧光结果×200

    A: 空白对照组; B: 正常对照组; C: p?NC组; D: TS1转染组; E: TS2转染组; F: TS4转染组; G: TS6转染组; H: TS7转染组.

    图4siRNA转染后14 d TLR4激光共聚焦结果×200

    M: 蛋白分子量标准; 1: 正常对照组; 2: p?NC组; 3: TS1转染组; 4: TS2转染组; 5: TS3转染组; 6: TS4转染组; 7: TS5转染组; 8: TS6转染组; 9: TS7转染组.

    图5siRNA转染后24 h RAW264.7细胞TLR4蛋白质表达Western Blot

    在TS4转染细胞，TLR4蛋白的水平在转染后14 d仍然维持较低水平，TLR4/GAPDH： 1 d: (0.0018±0.0004); 7 d:  (0.0023±0.0006); 14 d: (0.0030±0.0007, P>0.05）.

    2.4TLR4 siRNA对TNF?α和MIP?2 mRNA水平的影响我们用半定量RT?PCR分析了TLR4 siRNA对1 mg/L LPS处理组及非LPS处理组RAW264.7细胞TNF?α和MIP?2表达的影响. 结果显示，LPS刺激可增强正常对照组，p?NC组RAW264.7细胞TNF?α和MIP?2 mRNA的表达，在TS4转染组及TS6转染组这些因子的mRNA水平明显降低(图6)， 且在1 mg/L LPS刺激后仍处于较低水平，尤以TS4转染组明显. GAPDH mRNA的表达被用作内参照(191 bp).

    M: DNA分子量标准; 1: 正常对照组; 2: 仅行LPS刺激组; 3: p?NC组; 4: p?NC+LPS组; 5: TS4转染组; 6: TS4+LPS组; 7: TS6转染组; 8: TS6+LPS组.

    图6不同处理组间RAW264.7细胞TNF?α, MIP?2 mRNA表达RT?PCR

    2.5TLR4 siRNA减低RAW264.7细胞中TNF?a和MIP?2的分泌1 mg/L LPS刺激RAW264.7 细胞6 h后，TNF?α水平达(2895±213) μg/L. 这一作用被TS4 siRNA明显阻断［(759±152) μg/L,  n=3, P<0.05,表1］.

    MIP?2在1 mg/L LPS刺激后6 h，其水平明显升高，TS4明显降低，1 mg/L  LPS刺激组MIP?2分泌水平 ［(22490±3570)  μg/L vs (6787±1054) μg/L，  n=3, P<0.05,表1］.表1TLR4 siRNA对RAW24.7细胞TNF?α, MIP?2分泌水平的影响

    2.6TLR4 siRNA阻断LPS信号通路LPS活化RAW264.7细胞的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs) 通路 (细胞外信号调节激酶ERK 1/2, p38?MAPK)，这一活化作用在TS4转染组被明显阻断（图7）.

    1: 正常对照组; 2: 仅行LPS刺激组; 3: TS4+LPS组; 4: p?NC+LPS组; 5: TS7+LPS组; 6: TS6+LPS组.

    图7不同处理组间RAW264.7细胞p38?MAPK, ERK1/2蛋白质表达Western Blot

    3讨论

    众多研究表明，肝脏各类细胞膜上表达的TLR4可能通过启动下游的炎性应答基因表达及细胞因子释放而诱导出肝组织对LPS的炎性应答［2, 4, 6］.     TLR4可作为TLR4相关疾病的极有潜力的靶位［7］. 通过调控TLR4基因表达或许是包括重症病毒性肝炎在内的感染性疾病的一种新的防治策略. 在Ren等［8］的研究中, 证实了HBV特异的siRNA可静默HBV基因表达和抑制HBV的体外复制.

    　　本实验构建了7条针对小鼠TLR4的小干扰RNA(siRNA)表达载体，酶切及测序鉴定正确，体外对RAW264.7细胞进行转染试验证实，有TS4, TS6及TS7 3条载体可有效降低TLR4 mRNA水平及蛋白表达水平，其中TS4效果最佳. 在稳定转染组，TS4的抑制效果持续且稳定.

    TNF?α是免疫和炎症反应中强有力的核心调控介质，为LPS信号转导分析的一个较好的指标. 上调表达的TNF?α导致炎症级联反应，诱导MIP?2的表达，MIP?2的局部分泌促使大量中性粒细胞募集，加速炎症进程，导致器官损伤.  　本研究表明TLR4 siRNA可减低TNF?α， MIP?2两者的mRNA表达和蛋白水平. LPS刺激亦不能使TLR4 siRNA转染细胞的TNF?α和MIP?2的表达水平恢复. 这提示TLR4在细胞因子基线水平表达、刺激信号上调特定因子方面是至关重要的.

    ERK和p38是LPS信号通路调控的重要指标. 本研究发现在TLR4 siRNA转染的巨噬细胞中，LPS诱导的ERK1/2和p38磷酸化水平被明显抑制，而pNC siRNA转染组及正常对照组LPS反应未受抑制，这提示TLR4 siRNA对LPS信号通路的特异性抑制作用. 　　本研究提示TLR4 siRNA诱导的LPS耐受，是由巨噬细胞中下调的TLR4导致的. TLR4表达的下调降低了巨噬细胞样细胞RAW264.7细胞中的TNF?α和MIP?2分泌水平，尽管其具体分子机制仍不清楚，但p38?MAPK和ERK1/2磷酸化水平的降低很可能与此有关.

    综上所述，TLR4 siRNA下调TLR4表达在调控LPS诱发的炎症免疫反应方面可能有治疗应用价值，这方面的深入研究将为了解包括肝衰竭在内的TLR4相关疾病的发病机制和其潜在治疗价值提供有用的信息.

【】
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