不同配方CPC DBM rhBMP?2复合材料的抗压性能和超微结构特征

            作者：任民，周勇，蔡和平，马保安，张殿忠，周本根，苟永胜 

【摘要】  　　目的： 探讨脱钙骨基质颗粒(DBM)/磷酸钙骨水泥(CPC)/重组人骨形成蛋白?2(rhBMP?2)复合材料的抗压性能和超微结构特征，找出该复合材料的最佳配方. 方法： 预制兔DBM，用吸附法将rhBMP?2 与DBM复合后，再按不同的质量比与CPC复合. 复合材料行体外抗压强度测定和扫描电镜观察. 结果： DBM的质量比在0.2~0.4的范围内，复合材料中存在较多100 μm以上的不规则裂隙. DBM的质量比≤0.1时，材料内部的大部分间隙<100 μm. DBM的质量比≥0.5时，DBM和CPC丧失结合及塑型能力. 随DBM质量比的增加，材料抗压极限强度递减，质量比为0.1，0.2，0.3，0.4的抗压极限强度分别为（8.12±0.79）MPa，(5.46±1.13)MPa，(5.13 ±1.18)Mpa和(1.49±0.61)MPa. 各组数据经方差分析，差异具有统计学意义 (P＜0.05)，其中质量比为0.2，0.3，两组比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，而(1.49±0.61)MPa小于人体松质骨的平均抗压强度. 结论： 随着DBM质量比的增加，孔隙越丰富而材料力学强度逐渐降低. DBM质量比为0.2 ~ 0.3的复合材料可用于修复低承重部位松质骨的骨缺损.

【关键词】  磷酸钙类；骨粘合剂；脱钙骨基质；骨形态，发生蛋白质?2；抗压强度

    【Abstract】 AIM:  To analyze the compressive strength and  ultramicrostructure propertie of composition of decalcified bone matrix(DBM) impregnated calcium phosphate cement(CPC) with recombinant human bone morphogenetic protein?2(rhBMP?2), and to investigate the best component proportion of the  composition. METHODS: The rabbit DBM was  prepared beforehand. The rhBMP?2 and DBM were mixed with adsorption. The mixture was added into CPC material at different weight proportions and these compositions were solidified and examined by biomechanics and scanning electron microscope(SEM). RESULTS:  There were many irregular gaps of more than 100 μm in the composition, when the proportion of DBM was from 0.2 to 0.4. Most of gaps’ diameters were less than 100 μm when the proportion of DBM was no more than 0.1. The DBM and CPC couldn?t be consolidated when the proportion of DBM was no less than 0.5. The compressive strength of the compositions was progressively decreased, in accordance with the increase of proportions of DBM. With the proportion of DBM being 0.1, 0.2, 0.3 and  0.4, the ultimate compressive strength  was (8.12±0.79), (5.46±1.13), (5.13±1.18) and  (1.49±0.61) MPa, respectively.  A significant difference (P<0.05) was found in the statistical comparison of the different groups with regard to the composition?s ultimate compressive strength, except between 0.2 and 0.3. But the mean value of human  cancellous bone?s compressive strength was strikingly higher than 1.493 MPa. CONCLUSION: Along with the increasing  proportion of DBM,  the porosity of compositions is ascended, contrarily the compressive strength of compositions is descended accordingly. Compositions with DBM proportion of 0.2?0.3 can  be used in repairing cancellous bone?s gap where  bears lower load.

    【Keywords】 calcium phosphates; bone cements; decalcified bone matrix; bone morphogenetic protein?2; compressive strength

　　 0引言

    　　骨缺损修复目前仍是骨科界尚未解决的难题. 用人工材料修复骨缺损一直是骨缺损修复材料研究开发的热点之一. 磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement, CPC）因其独特的优点［1］,已成为被寄希望的骨缺损修复材料. 但新近研究表明由于CPC诱导成骨能力较差、在体内降解过慢等缺点［2-3］，其临床单独应用的效果并不理想. 因此，人们纷纷对之进行改型，希望研制出一种能克服上述缺点的新型磷酸钙骨水泥材料运用于临床. 本实验将CPC、脱钙骨基质颗粒(decalcified bone matrix ，DBM)及重组人骨形成蛋白?2（recombinant human bone morphogenetic protein?2, rhBMP?2）制成复合材料，通过体外生物力学实验和结构形态观察，探讨该复合材料的力学性能和结构特征，为进一步的骨缺损修复实验奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料自固化CPC由华东理工大学研制，购于上海瑞邦公司. rhBMP?2 由珠海宏昱生物技术有限公司馈赠. 兔异体DBM由第四军医大学唐都全军骨科中心骨库加工制备. 兔骨来源：健康成年大耳白兔50只，雄性，6 mo龄，体质量2.5 kg左右，由第四军医大学实验动物中心提供. 扫描电镜(日产?JSM?35C型)和MTS?858生物材料力学实验机均由西安大学材料和力学国家重点实验室提供.

    1.2方法

    1.2.1DBM的制备Urist法［4］取成年兔四肢长骨皮质骨，剃除软组织及骨髓. 依次无水乙醇、乙醚浸泡，4℃下干燥;骨片入液氮冷冻30 min后用粉碎机将骨片粉碎成骨粒，筛取粒度100～300 μm的骨粒于-80℃冷冻保存.

    1.2.2复合材料的制备按需要一定量的rhBMP?2溶于蒸馏水中，再加入DBM中充分混匀，真空下复合，-30℃预冷后入-80℃冻干机真空干燥，备用. 按1 g CPC粉末加入0.2 mL固化液比例，将固、液成分混匀，搅拌至面糊状，将备用的rhBMP?2/ DBM复合物分别按DBM:CPC质量比1/9，2/8，3/7，4/6，5/5，6/4，7/3比例加入，边加入边搅拌混匀. 加压装入模具中，37℃水浴条件下凝固，脱模，形成各种形状的复合材料若干个. 最终材料的配方为DBM :复合材料的质量比分别是0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，复合材料含rhBMP?2的量约1.2×106 mg/m3（预先计算所要混入的rhBMP?2的质量＝1.2×106 mg/m3×模具的体积）. 封装，环氧乙烷消毒，-80℃冷冻保存备用.

    1.2.3对照组CPC材料的制备按1 g CPC粉末加入0.2 mL固化液比例将固、液成分混匀，搅拌、装模、固化［5］.

    1.2.4生物力学测试样本制备按上述制备过程，将混匀后的材料加压装入内径为6 mm的圆柱状模具中，一端封闭，另一端用质量为5 kg砝码加压30 s. 凝固、脱模后，间隔8 mm段截，形成若干个直径6 mm，高8 mm的圆柱状标准抗压试件［6］.

    1.2.5不同配方复合材料抗压强度测试质量比为0.1～0.7的复合材料及单纯CPC材料中各随机挑选l0个抗压试件组成测试样本，用MTS?858生物材料力学试验机进行抗压强度测试. 两端夹持圆柱状试件的两底面，两端即为压头. 垂直底面进行加压，压头加载速度1 mm/min，从记录的力与变形关系曲线上采集数据. 至曲线的最高峰值陡直下降即材料进入颈缩期始，得最大压力(N)，用公式P=N/S计算抗压极限强度(P)，计算平均值.

    1.2.6扫描电镜下材料结构形貌特征观察将各组材料标本分别制成断裂样本［6］. 用乙醇梯度脱水，真空干燥、喷金，断裂表面于扫描电镜下观察不同配方的CPC/DBM/rhBMP?2，CPC材料的内部孔隙分布及孔径大小等结构特征.

    统计学处理： 实验结果用x±s表示，用SPSS 11.0软件进行统计学分析. 数据行多样本方差齐性Levene检验，检验水准α=0.10. 经检验满足正态分布，进一步行多样本单因素方差分析及LSD?t检验，检验水准α=0.05.

    2结果

    2.1抗压强度测试结果质量比≥0.5的复合材料凝固后粘接很松散，稍加外力即破溃，失去可塑型性，没有力学测量意义；质量比为0.1，0.2，0.3，0.4的复合材料抗压极限强度分别为（8.12±0.79）MPa，(5.46±1.13) MPa，(5.13±1.18) MPa，(1.49±0.61) MPa；单纯CPC材料为（10.38±0.51）MPa. 将以上5组材料数据与新鲜胫骨上端、股骨下端松质骨抗压极限强度（3.51±1.01）MPa，(3.69±0.47) MPa［7］行方差齐性Levene检验，得P=0.16. 经检验满足正态分布，进一步行方差分析及LSD?t检验. ANOVA得P≈0.00；LSD?t检验得0.2与0.3两组比较得P=0.26，其余各组间比较均得P＜0.05. 故不认为DBM质量比为0.2与0.3的两组抗压极限强度有统计学差异，而其余各组抗压极限强度认为均有统计学差异. 这表明随着CPC材料中掺入的DBM成分增多，复合材料的抗压强度在下降，其中质量比为0.2，0.3两组抗压强度相近，质量比≤0.3的复合材料抗压极限强度超过了人股骨下端和胫骨上端某些部位的松质骨强度，而≥0.4则材料抗压极限强度不及该部位松质骨.

    2.2扫描电镜观察各组材料结构原始形态见图. 单纯CPC材料结构致密，颗粒排列整齐，孔隙大小基本一致，分布均匀，孔径大部分在20～100 μm（图1）. 复合材料颗粒排列不整，孔隙大小不一致，分布不均， DBM镶嵌在CPC颗粒中，与周围结合松散，DBM裸露部位周围出现较多50～400  μm的裂隙（图2）. DBM的质量比≤0.1时，材料内部的孔径大部分和CPC材料相近(图2A). DBM的质量比在0.2~0.4的范围内，复合材料中存在较多100  μm以上的不规则裂隙，其中DBM的质量比0.2与0.3的两组材料，孔径大小大部分接近（图2B，C）. DBM的质量比≥0.5时，DBM和CPC复合后因不能结合塑形，失去观察意义. 随着复合材料中DBM质量比的增加，材料内部孔隙更加丰富，孔径更大. DBM与CPC结合更松散，裸露部位更多，与周围形成的自然裂隙也更宽（图3）.

    图1扫描电镜观察单纯CPC材料结构形态×100

    3讨论

    　　DBM因机械强度差，塑形能力差，故难以满足填补骨缺损的作用. BMP无载体情况下修复节段性骨缺损的效果不好. 本实验将二者与CPC有机的复合成材，既具有可塑性、满足修复不同部位骨缺损的需要，又含有诱导成骨物质，为其在体内成骨提供一种可能性.

    本材料制备方法是于凝固前将材料装进模具内加压成形，在37℃下凝固，这与手术中将材料加压填塞骨缺损过程类似，温度条件也一致. 本方法采用按质量比进行调和便于实际操作，其中的BMP含量很小，对质量比值影响甚微，可以忽略不计. rhBMP?2干粉是在中性环境下溶解复合的，它的活性损失最小［8］. 从实验结果可以看到，随着DBM的质量比增加，极限抗压强度迅速降低. 这是因为DBM的比重要比CPC轻，且结构更加疏松，故随着DBM质量比的增加，会使它在材料中所占的体积比成倍增加，而同时CPC占的体积比却急剧减小，CPC颗粒间的结合力是构成该复合材料的主要力学基础，故而凝固后的结合力会明显减弱. 另外，DBM的体积比例增加不但会带来自身结构上的孔隙，而且会在材料内造成A: DBM质量比0.1; B: DBM质量比0.2; C: DBM质量比0.3.

    更大的天然裂隙及更丰富的孔隙，也是引起材料的极限抗压强度的下降的原因. 而质量比为0.2与0.3的两组材料虽然DBM占的体积比例各不同，但极限抗压强度却没有差异，其机理尚待研究. 将本实验材料植入骨缺损部位，推测在体内37℃，100％湿度环境下将会强化CPC的凝固性能，提高材料的力学强度［9］.

    有研究表明支架材料孔径在200～500 μm 范围内、空隙率为42%~62%，才有利于细胞、组织长入［10］. 本实验结果可见， DBM的质量比在0.2~0.4的范围内，复合材料中存在较多100 μm以上的裂隙，当质量比≤0.1时，材料内部的孔径大部分和CPC材料相近，质量比≥0.5时，DBM和CPC不能有效地凝固在一起. 可能的机理是由于DBM 骨粒的不规则性致DBM 骨粒与CPC界面间不能完全紧密结合，同时随着DBM 在材料中所占质量比增加，CPC成份减少，DBM 与CPC间的结合部位也相应减少，故而DBM 骨粒裸露面积增大，其周围产生了较多不规则的自然裂隙. 推测这些裂隙日后将被新骨长入填充. 材料含的CPC具有一定降解能力，随新骨长入降解产生新的孔隙，为新骨继续长入留出空间. 新骨不断占据材料孔隙将会加强其力学性能，使其更符合身体负重的力学要求.

    　　本实验结果显示：将质量比≤0.3的材料植入股骨下端和胫骨上端的松质骨缺损部位，能够满足正常负重的需要，提示临床应用时，于填充骨缺损后可以早期负重. 而质量比≥0.4的材料强度不够，不能单独用于修复该部位骨缺损，应用时要联合使用其他固定系统，在保护下负重. 本研究认为如要进一步研究材料在体内成骨的性能，选择质量比为0.2～0.3的材料为佳. 因为这两者孔隙大小接近、具有较多的100 μm以上的天然裂隙，并且极限抗压强度也没有差异，能够满足修复人体低承重部位松质骨缺损的部分条件，有必要对其进行研究.

【】
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