三七总皂苷对子宫内膜异位症内膜VEGF及其受体KDR表达的影响
【关键词】 子宫内膜异位症 血管内皮生长因子 受体 三七总皂苷注射液
0引言子宫内膜异位症(endometriosis, EM)是一种常见的妇科良性疾病，其发病机制尚未明了. 但是当脱落的子宫内膜附着在腹膜或其他部位时，新的血供的建立和维持是子宫内膜异位种植存活和的基本条件. 血管生成不仅在正常子宫内膜的生长修复中起作用，而且在子宫内膜异位症的发生发展中占有重要的位置. 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是重要的血管生成因子，可直接而特异地作用于血管内皮细胞，导致新生血管形成. 三七是五加科人参属植物，传统用于止血化瘀和消肿镇痛，其主要有效成分为三七总皂苷. 我们应用三七总皂苷子宫内膜异位症如下.
1对象和方法
1.1对象2006?01/2007?09我院确诊为EM的患者80例，同期门诊体检健康妇女40人为对照组(非月经期、非孕期)，均无免疫性疾病，两组对象均未用激素类药物及其他药物和手术，无心、肝、肺、肾等重要脏器疾患，肝、肾功能试验正常.
1.2方法三七总皂苷注射液（血塞通，济南海泰医药科技有限公司生产），鼠抗人KDR购自美国Santa Cruz公司，免疫组化用SP试剂盒购自深圳晶美生物制品有限公司，DAB购自美国Sigma公司. PCR仪购自武汉博士德生物公司采用同济千屏影像公司提供的HPIAS?1000彩色图像分析系统对VEGFKDR免疫组化标本进行分析处理. 三七总皂苷注射液250 mL（含三七总皂苷0.2 g），静滴，1次/d，疗程3 mo. 患者治疗前及治疗后1，3 mo均在月经干净的3～7 d内取子宫内膜组织1次、正常对照组取1次，用半定量RT?PCR检测VEGF mRNA的表达，用免疫组化SP法检测该受体KDR的表达. 疗效判定标准：痊愈：症状全部消失，盆腔包块等局部体征基本消失，不孕症患者在治疗及停药3 mo内妊娠；显效：症状基本消失、盆腔包块缩小，不孕症患者得以受孕；有效：症状减轻，盆腔包块无变化，停药3 mo症状不加重；无效：主要症状无变化或恶化，局部病变加重. 常规用碘伏消毒阴道、宫颈，将顶端带有内膜采集器的内芯连同外套管顺应子宫纵轴方向置入宫底，后退套管约2 cm，伸出内膜采集器，在相同部位顺时针旋转1 wk刮取内膜后退入套管内与套管一并撤出. 将刮取获得的子宫内膜组织用生理盐水冲洗、滤纸吸干水分、分为2份，称质量后置入甲醛浸泡，置-70℃液氮罐中冻存各1份，待统一检测.
1.2.1VEGF mRNA受体的检测取50～100 mg组织以Trizol试剂提取RNA，具体操作按试剂盒说明进行，提取后以紫外光分光光度计测定其纯度并定量，在甲醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性. 半定量RT?PCR采用厂家推荐步骤进行，以GAPDH扩增产物为内参照. 引物序列参照设计，RT?PCR反应体系及反应条件参照文献并稍加优化，VEGF165引物序列:上游5′?CAGGCTGCTGTAACGATGAA?3′，下游5′?AAATGCTTTCTCCGCTCTGA?3′，扩增产物为280 bp；β?actin引物序列:上游5′?AGCCATGTACGTAGCCATCC?3′，下游5′?CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA?3′，反应总体积50 μL，扩增产物为208 bp. PCR反应条件:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，持续35个循环. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行吸光度扫描，将VEGF mRNA扩增条带的光密度值与β?actin的吸光度值之比作为衡量参数，分析VEGF mRNA的表达.
1.2.2VEGF受体(KDR)蛋白表达的检测KDR抗体稀释浓度为1∶100，DAB显色，测定细胞内阳性的平均吸光度值，结果判定，每张切片随机选取3～5个视野(200倍)，细胞内不着色的为阴性细胞，细胞质内有棕黄色反应物，染色明显高于背景者为阳性细胞.
统计学处理：所有数据用SPSS13.0统计软件处理，自身对照数据采用配对样本的t检验，组间数据比较采用两样本均数比较t检验.
2结果
EM患者80例经三七总皂苷治疗3 mo后，痊愈50例（62.5%）；显效15例（16.8%）；有效5例（7.3%）；无效10例（12.5%），总有效率为87.5%. 副作用：治疗期间，10例15 d 后出现头晕，不欲饮食，5 d后症状缓解. 与对照组相比，EM患者VEGF mRNA,VEGF受体KDR表达均升高，差异均有统计学意义(P<0.01，表1）. 用三七总皂苷治疗治疗1 mo和3 mo后，子宫内膜VEGF mRNA，VEGF受体KDR表达均降低，与治疗前自身比较，差异均有统计学意义(P<0.01～0.05). 治疗1 mo与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，治疗3 mo与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，治疗3 mo和1 mo比较，差异均有统计学意义(P<0.01，表1，图1）. VEGF受体KDR与VEGF mRNA之间呈正相关（γ=0.623，P<0.05）.
表1EM治疗期间VEGF?CmRNA和VEGF受体KDR的表达(x±s)组别〖〗治疗〖〗VEGF?C mRNA〖〗KDR治疗〖〗前〖〗5.67±0.43b〖〗4.21±0.60〖〗1 mo后〖〗4.18±0.20b,c〖〗3.09±0.32c〖〗3 mo后〖〗2.17±0.34d,f〖〗1.05±0.14f对照〖〗〖〗1.88±0.32〖〗0.86±0.05bP<0.01 vs 对照组; cP<0.05, dP<0.01 vs 治疗前; fP<0.01 vs 治疗1 mo后.
M: DL 2000 marker; 0: 空白对照; 1~3: 治疗前; 4~6: 治疗1 mo; 7~9: 治疗3 mo.
图1VEGF mRNA的表达凝胶电泳图
3讨论
Mumhra等［1］报道VEGF可促进微血管内皮细胞释放前列腺素(PGI2)与一氧化氮(NO)，导致血管收缩功能下降，使血管扩张，同时使血管通透性增加，使血液中大分子物质如血浆蛋白外渗，组织充血水肿. 此外，VEGF可促进血管内皮细胞组织型纤溶酶原激活剂(t?PA)的产生，激活血管外凝血反应，促进纤维蛋白水解，影响止血反应而导致异常出血［2］. 本次研究结果显示，EM前子宫内膜VEGF受体KDR，VEGF mRNA的表达均比正常对照组高. 提示VEGF可能参与子宫内膜异位症的发生和.
VEGF受体有两种即人源分泌型酪氨酸激酶(Flt?1)和KDR，有研究表明VEGF主要通过与位于血管内皮细胞的受体KDR的结合而发挥其血管通透性等生物学作用［3］. 目前，调控VEGF受体分泌的机制尚不清楚，大多数研究认为缺氧、细胞因子和生长因子等对VEGF受体的表达都起着主要的调控作用. Nayak等［4］研究发现，VEGF可与定位子宫内膜基质细胞的KDR结合，增加基质金属蛋白酶MMPS的表达，降解胶原纤维和Ⅳ型胶原，可进一步导致血管脆性增加和破坏血管内皮细胞的完整性. 本研究结果显示，治疗后子宫内膜VEGF受体KDR的表达均降低，且VEGF mRNA的表达与KDR的表达呈正相关. 提示三七总皂苷可能抑制了VEGF表达的同时也抑制了KDR的表达.
血塞通是由中药三七提取的纯中药制剂，其有效成分三七总皂苷，具有阻断炎性病理改变，明显升高中性粒细胞内cAMP含量，从而抑制炎性细胞释放自由基而产生抗炎活性，同时还具有改善微循环、降低毛细血管通透性，稳定细胞膜、减轻组织水肿等作用. 我们发现血塞通治疗子宫内膜异位症1 mo和3 mo后，血浆VEGF水平显著降低，与正常对照组比较，3 mo后虽仍高于对照组，证明血塞通治疗子宫内膜异位症有效，且副作用少，值得临床进一步推广.
【】
［1］ Murohara T, Horowitz JR, Siliver M，et al. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor enhances vascular permeability via nitric oxide and prostacylin［J］. Reproduction, 2001,121(3):307.
［2］ Classen?linke I, Alfer J, Krusche CA, et al. Progestins, progesterone recep tormodulators, and progesterone antagonists change VEGF release ofendometrial cells in culturel［J］. Steroids, 2000,65(10-11):763.
［3］ Endo A, Fukuharas, Masuda M, et al. Selective inhibition of vascular endothelial growth factor receptor?2(VEGF?2) indentifies a central role for VEGF?2 in human aortic endothelial cell responses to VEGF［J］. J Recept Signal Transduct Res, 2003,23(9):239.
［4］ Nayak NR, Critchley HO, Slayden OD,et al. Progesterone withdrawal up?regulates vascular endothelial growth factor recep tor type 2 in the superficial zone stroma of the human and macaque endometrium: Potential relevance to menstruation1［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85(7):3442.
