RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体的构建及序列测定

               作者：游捷 ，黄清玲 ，林旭 ，刘礼斌 ，林建银  

【摘要】  目的 构建晚期糖化终产物受体（RAGE）、核因子-κB（NF-κB）反义RNA单/双基因共表达载体。 方法 从人脐静脉内皮细胞ECV304中提取总RNA，RT-PCR扩增RAGE基因片段;从糖尿病人外周血单核细胞提取总RNA，RT-PCR扩增NF-κB p65基因片段。分别克隆入PGEM-T载体，酶切鉴定阳性克隆，再经PCR反应获得多量的RAGE，NF-κB基因片段，反向插入双启动子真核表达载体pBudCE4.1，构建RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体。 结果 RT-PCR扩增出RAGE基因片段328bp，扩增出NF-κB p65基因片段364bp。测序分析证实目的基因片段正确反向插入3个重组载体。 结论 RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体构建成功。

【关键词】  RNA，反义;基因表达调控;糖基化终产物，高级;糖基化;NF-κB;基因;DNA，重组;遗传载体

　晚期糖化终产物（AGE）在糖尿病、肾功能衰竭、衰老、炎症等情况下明显增加。AGE主要通过晚期糖化终产物受体（RAGE）介导病理情况。目前认为，AGE-RAGE作用后可引起核因子（NF）-κB的激活。NF-κB是调节RAGE表达的一个启动子，因此NF-κB的激活作为一种正反馈，进一步促进了AGE与RAGE的结合 ［1-2］ 。笔者构建RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体，为今后进一步研究阻断AGE-RAGE的策略打下基础。
    
　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料 E.coli Top 10 、PGEM-T载体、双启动子型真核表达载体pBudCE4.1、高保真PCR酶、dNTP、一步法RT-PCR试剂盒、Trizol、Zeocin、IPTG、X-Gal、DEPC（Invitrogen公司）。限制性内切酶、T 4 DNA连接酶（Biolab公司）。胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒（上海华舜生物制品公司）。人脐静脉内皮细胞ECV304（中科院上海细胞生物研究所）。上海博亚生物技术有限公司合成引物及测序。

　　1.2 方法
   
　　1.2.1 根据GeneBank报道的人RAGE基因（GeneBank登录号AB036432）、人NF-κB p65基因（GeneBank登录号M62399）设计引物，扩增RAGE基因序列的14-342位的328bp序列。扩增NF-κB p65基因序列的14-378位的364bp序列。PCR引物如下:
    
　　RAGE F:5'-GGG GTA CCA AGG AAG CAG GTA GGC AGC C-3'
   
　　RAGE R:5'-CCG CTC GAA TCC ATT CCT GTT CAT CTG C-3'
    
　　NF-κB p65F:5'-CGC GGA TCC TGG CTC GTC TGT AGT GCA CG-3'
   
　　NF-κB p65R5'-CCC AAG CTT TAG AAG CCA TCC CGG CAG TC-3'
    
　　1.2.2 RAGE、NF-κB基因的体外扩增及扩增片段的回收 Trizol试剂提取ECV304总RNA，RT-PCR扩增RAGE基因片段，反应体系:总体积50μL由引物RAGE R，RAGE F各3μL、RNA3μL、dNTP1μL、5×buffer缓冲液10μL、RT/Taq酶1μL、DEPC水26.5μL构成。反应条件:55℃逆转录反应60min→94℃变性2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min，共30循环，72℃延伸7min。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳。另取一名血糖控制较差、无急性并发症的糖尿病人外周血有核细胞提取总RNA用于扩增NF-κB基因片段，RT-PCR反应体系、反应条件同上。胶回收试剂盒回收2种目的基因片段。
   
　　1.2.3 RAGE、NF-κB基因PGEM-T载体克隆 将目的基因RAGE、NF-κB片段与PGEM-T连接，并转化感受态细胞E.coli Top 10 ，将菌液涂抹至预先制备含IPTG/X-Gal/氨苄青霉素的LB平板上，蓝白筛选，扩增阳性克隆并小量抽提质粒，xhoⅠ、kpnⅠ（RAGE）/HindⅢ、BamH I（NF-κB）双酶切鉴定。阳性质粒命名为PGEM-T/RAGE，PGEM-T/NF-κB。
   
　　1.2.4 pBudCE4.1/RAGE重组载体的构建 取PGEM-T/RAGE质粒DNA，用引物RAGE R、RAGE F扩增RAGE目的基因。PCR反应体系:总体积50μL，由引物各3μL，质粒DNA2μL，dNTP1μL，10×buffer缓冲液5μL，高保真PCR酶1μL，50mmol/L MgCl 2 1.5μL，双蒸水34μL构成。反应条件:94℃2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min，共30循环，72℃7min。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳。按前述方法进行纯化，以备构建重组表达质粒用。扩增后的RAGE目的基因及pBudCE4.1分别用xhoI、kpnI双酶切并纯化回收。将目的基因片段与载体连接，并转化相应的感受态细胞E.coli Top 10 ，根据该载体所含的Zeocin抗性，用含Zeocin的低渗LB培养液筛选阳性克隆，扩增阳性克隆并小量抽提质粒，xhoI、kpnI双酶切鉴定，并用该质粒通用引物BGHR，EFIF测序。测序正确的重组体命名为pBudCE4.1/RAGE。
   
　　1.2.5 pBudCE4.1/NF-κB载体及pBudCE4.1/RAGE+NF-κB载体的构建 取PGEM-T/NF-κB质粒DNA，用引物NF-κB R，NF-κB F扩增NF-κB目的基因:PCR反应体系及反应条件同RAGE基因。扩增后的NF-κB目的基因及载体pBudCE4.1、pBudCE4.1/RAGE分别用HindⅢ、BamHI双酶切并纯化回收。连接、转化、筛选同上。测序用引物T7F，MycR。测序正确的重组体命名为pBudCE4.1/NF-κB和pBudCE4.1/RAGE+NF-κB。
    
　　2 结果
    
　　2.1 RAGE、NF-κB基因的体外扩增及扩增片段的回收 两种总RNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳观察显示28S与18S清晰的两条RNA带。用紫外分光光度计分析纯度要求D 260nm /D 280nm ≥1.8。从ECV304细胞总RNA经过RT-PCR扩增出RAGE的目的片段328bp，但未扩增出NF-κB的目的片段。从一名血糖控制较差的糖尿病人外周血有核细胞提取总RNA扩增出了NF-κB基因364bp，但回收后量较少，先进行PGEM-T克隆。
   
　　2.2 PGEM-T/RAGE，PGEM-T/NF-κB载体构建 将RAGE，NF-κB的目的片段克隆入PGEM-T，分别挑5和7个单菌落，经xhoⅠ、kpnⅠ（RAGE）/HindⅢ、BamHI（NF-κB）双酶切鉴定。RAGE的阳性重组质粒酶切出现两个片段与理论值相符，NF-κB的阳性重组质粒酶切出现两个片段亦与理论值相符，初步说明PGEM-T/RAGE，PGEM-T/NF-κB载体构建成功。
   
　　2.3 pBudCE4.1/RAGE载体的构建 取PGEM-T/RAGE的阳性重组质粒PCR扩增出大量RAGE基因片段，克隆入pBudCE4.1，挑6个单菌落双酶切鉴定。阳性重组质粒酶切出现两个片段与理论值相符，初步说明pBudCE4.1/RAGE的构建成功（图1）。以pBudCE4.1上的BGHR，EFIF为测序引物进行序列分析显示，RAGE基因片段正确完整反向插入pBudCE4.1的xhoⅠ、kpnⅠ位点间。

  
　　2.4 pBudCE4.1/NF-κB及pBudCE4.1/RAGE+NF-κB载体的构建 取NF-κB的阳性重组质粒PCR扩增出大量NF-κB基因片段，分别克隆入pBudCE4.1和pBudCE4.1/RAGE，挑3和2个单 菌落，经双酶切鉴定。阳性重组质粒酶切出现两个片段与理论值相符，初步说明pBudCE4.1/NF-κB及pBudCE4.1/RAGE+NF-κB载体构建成功（图2）。以pCudCE4.1上的T7F，MycR为测序引物进行序列分析显示，NF-κB基因片段正确完整反向插入pBudCE4.1和pBudCE4.1/RAGE的HindⅢ、BamHI位点间。
  
　　M:标准分子量（分子量依次为7000，3000，2000，1000，750，500，250，150bp）. 1:空载体pBudCE4.1. 2:RAGE目的片段. 3:pBudCE4.1/RAGE载体的双酶切.
    
　　图1  pBudCE4.1/RAGE载体的双酶切鉴定（略）

　　M:标准分子量（分子量依次为7000，3000，2000，1000，750，500，250，150bp）. 1，3:pBudCE4.1/NF-κB及pBudCE4.1/RAGE+NF-κB重组载体. 2，4:pBudCE4.1/NF-κB及pBudCE4.1/RAGE+NF-κB重组载体的双酶切.
    
　　图2  pBudCE4.1/NF-κB及pBudCE4.1/RAGE+NF-κB载体双酶切鉴定（略）

　　3 讨论
    
　　随着生活水平的提高，糖尿病已逐渐成为危害人类健康的严重疾病。糖尿病的慢性并发症是其主要致残、致死的原因，而持续高血糖所致AGE的蓄积是引起糖尿病并发症的主要因素。因此研究AGE作用的机制，探讨从效应远端阻断其作用的可能性有十分重要的意义。AGE可与蛋白质、脂质、核酸等结合，通过直接作用引起结构功能改变，还可通过受体起间接作用。AGE受体主要有五种，其中RAGE的研究较深入，主要介导细胞内应激损伤。RAGE是一种多配体的免疫球蛋白超家族成员。在正常的内皮细胞仅表达少量RAGE，当AGE增多时可上调RAGE，RAGE作为信号传导受体激活p21ras，引起丝裂素活化蛋白激酶的激活和转录因子NF-κB的核转位，最终导致血管通透性增高，血管收缩，单核细胞黏附，基质成分增多等损伤，是糖尿病并发症的发生和的一个重要原因 ［3］ 。
   
　　目前阻断AGE-RAGE被作为一个新的防治糖尿病慢性并发症的靶点 ［4］ 。有报道氨基胍在体外能抑制AGE的合成，减少糖尿病大鼠肾脏AGE的蓄积，但在糖尿病肾病已形成后再投药不能逆转病变过程，且因其副作用至今未能应用于临床。抗RAGE抗体和可溶性RAGE（RAGE的细胞外域部分，可特异结合AGE，但由于不具备细胞内域部分，所以不介导生物效应）在体外可阻断AGE-RAGE所引起的氧化应激，但是抗体性质不稳定也未得到进一步应用 ［5］ 。Angelike等采用RAGE反义寡核苷酸技术通过瞬时转染实验可部分阻断AGE所致的NF-κB的激活，但其基因表达的效率较低 ［6］ 。有学者提出用基因敲除的方法阻断RAGE的表达 ［4］ ，但未见进一步的研究报道。
   
　　反义RNA技术是利用基因重组，构建人工表达载体，使其表达反义RNA通过碱基互补与靶RNA配对结合，抑制靶基因的表达，从而对细胞的功能产生影响。pBudCE4.1是由pBudCE4演变而来的高效真核表达载体，全长4.6kb，含有两个启动子:人类巨细胞病毒启动子和延长因子亚单位启动子，能同时插入两个基因共表达。其编码区含Zeocin抗性基因，便于Zeocin筛选。本研究根据AGE-RAGE信号通路设计两个靶基因，应用反义RNA技术建立RAGE，NF-κB单/双基因反义RNA共表达载体从基因转录水平逐级阻断AGE信号传导通路，为防治糖尿病慢性并发症提供新的策略。在实验中成功地从ECV304细胞总RNA中扩增出RAGE的目的片段，但未扩增出NF-κB的目的片段，考虑在未受刺激的内皮细胞中NF-κB主要存在细胞质，胞核内少，所以未扩增出NF-κB的目的片段。又从1名血糖控制较差的糖尿病人外周血有核细胞提取总RNA扩增出了NF-κB基因，这可能是 因为血糖控制较差的糖尿病人体内存在如高血糖等的应激因素刺激了NF-κB核内移。由于通过上述方法得到目的基因量少，又进行了目的基因的PGEM-T载体克隆，得到了足够的目的基因用于重组载体的构建。
   
　　本研究构建了三个反义RNA载体，可用于单一阻断RAGE或NF-κB的表达或同时阻断以上2个基因的表达，了解阻断RAGE信号传导是否可用于防治糖尿病并发症。本研究实现2个基因的共表达，可能增加基因的有效转移，提高表达水平，产生协同作用。由于这一工作的完成，笔者正进一步通过稳定转染筛选RAGE、NF-κB低表达的内皮细胞克隆株，深入研究AGE对内皮细胞功能的影响及应用反义RNA技术从基因转录水平逐级阻断AGE信号传导通路的效果和意义。

【】
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　　［2］ Lander HM，Tauras JM，Ogiste JS，et al.Activation of the recep-tor for advanced glycation end products triggers a p21（ras）-depen-dent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxi-dant stress［J］.J Biol Chem，1997，272（28）:17810-17814.

　　［3］ Stern DM，Yan SD，Yan SF，et al.Receptor for advanced glyca-tion end products（RAGE）and the complications of diabetes［J］.Ageing Res Rev，2002，1（1）:1-15.

　　［4］ Stern D，Yan DS，Yan FS，et al.Receptor for advanced glycatio end products:a multiligand receptor magnifying cell stress in di-verse pathologic settings［J］.Adv Drug Deliv Rev，2002，54（12）:1615-1625.

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