三氧化二砷抑制U266细胞增殖、诱导凋亡及与血管内皮生长因子表达的关系
【摘要】 目的探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡的影响及与血管内皮生长因子(VEGF)表达的关系。方法四唑盐比色法(MTT)观察As2O3对U266细胞增殖的影响;缺口末端标记法(TUNEL)分析As2O3对U266细胞凋亡的影响;逆转录多聚酶链反应(RT?PCR)检测2 μmol/L As2O3不同处理时间后U266细胞VEGF mRNA表达的变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测As2O3不同浓度不同处理时间对U266细胞VEGF蛋白表达的变化。结果(1)As2O3明显抑制U266细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为2 μmol/L;(2)As2O3能诱导U266细胞凋亡,呈剂量依赖性;(3) As2O3(2,5,10 μmol/L)分别处理72 h后细胞培养上清中VEGF量呈剂量依赖性减少;(4)考虑细胞增殖对VEGF分泌的影响,2 μmol/L As2O3处理组的上清VEGF量与对照组的差别无统计学意义,RT?PCR显示2 μmol/L As2O3处理的U266细胞个体VEGF mRNA的表达无变化。结论As2O3可以诱导骨髓瘤细胞凋亡,抑制其增殖。As2O3可以通过抑制细胞增殖、诱导凋亡,减少肿瘤负荷,减少VEGF总量,但是不改变细胞个体VEGF的表达。
【关键词】 砷剂 多发性骨髓瘤 细胞凋亡 血管内皮生长因子类
多发性骨髓瘤(MM)是一种单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的浆细胞肿瘤,主要侵犯骨髓,也可侵犯髓外组织,常引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高黏滞血症及肾功能不全等一系列临床表现。目前,MM仍无法治愈。近几年来,国内外研究报道As2O3在复发和难治性MM的中取得可喜疗效[1]。基础研究也发现血管内皮生长因子（VEGF）通过多种途径、多样化机制参与MM的病理形成及临床特征的产生[2]。笔者以骨髓瘤细胞株U266为体外模型,探讨As2O3对骨髓瘤细胞作用后表达的变化,分析两者关系。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1细胞株骨髓瘤细胞株U266由上海第二军医大学附属长征血液科侯健教授惠赠。
1.1.2主要试剂As2O3(黑龙江伊达药业公司)用注射用水稀释至1×103μmol/L(储存液),原位细胞凋亡检测试剂盒、RT?PCR试剂盒(美国Promega公司),Trizol试剂(美国Invitrogene公司),人VEGF酶联免疫吸附试验试剂盒(美国Pierce公司),RPMI 1640培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养U266细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640液,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下的孵箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2MTT法检测As2O3对U266细胞增殖的影响将不同浓度As2O3处理48 h及半数抑制浓度(IC50)的As2O3处理不同时间后的样本置于酶标仪,检测光密度[D(492 nm)],每组设6个平行孔,以对照组(0 μmol/L)细胞增殖率为100％,按公式细胞增殖率:
细胞增殖率(%)＝[药物组D(492 nm)/对照组D(492 nm)]×100%
1.2.3TUNEL法检测原位细胞凋亡收集0,2,5,10 μmol/L As2O3处理36 h后的细胞,涂片后用新鲜配置的4 g/L多聚甲醛固定,0.2%Triton○RX?100室温渗透5 min,冲洗后加入TdT反应液,37 ℃温盒孵育60 min,1×SSC枸橼酸钠缓冲液浸泡15 min终止反应,加入1∶500辣根过氧化物酶100 μL,室温反应30 min,加入DAB混合液,出现淡棕色背景后冲洗,高倍镜下观察,DAB显色后凋亡细胞呈棕褐色。
1.2.4RT?PCR检测VEGF基因表达收集2 μmol/L As2O3不同处理时间组细胞,提取总RNA,按照试剂盒说明书合成cDNA。VEGF基因扩增引物及内参β?actin由上海生工生物工程有限公司合成。VEGF扩增片断为VEGF121 408 bp和VEGF165 541 bp。
上游:5/?gaagtggtgaagttcatggatgtc?3/
下游:5/?cgatcgttctgtatcagtctttcc?3/
内参β?actin基因
上游引物:5/?cgctgcgctggtcgtcgaca?3/
下游引物:5/?gtcacgcacgatttcccgct?3/
扩增片断为619 bp。PCR条件,VEGF 94 ℃ 30 s→64 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s,共32个循环产物,在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳,凝胶成像系统显示及分析结果。
1.2.5VEGF含量检测采用ELISA技术,按试剂盒说明书操作,样品及VEGF标准品均采用复孔,在酶标仪450 nm波长处测光密度[D(450 nm)],绘制标准曲线,求出曲线方程。
1.3统计学处理采用SPSS 11.5统计处理软件分析,单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析。
2结果
2.1U266细胞增殖不同浓度As2O3处理U266细胞48 h后,U266细胞的增殖率与药物剂量呈负相关,IC50为2 μmol/L(图1)。用2 μmol/L As2O3处理U266细胞后,其增殖率与药物处理时间也呈负相关(图2)。
2.2U266细胞凋亡2,5,10 μmol/L As2O3分别处理U266细胞36 h后,对照组几乎未见凋亡细胞,而各处理组均出现棕褐色的凋亡细胞,并随处理浓度增加而增多(图3)。
2.3As2O3对U266细胞VEGF分泌的影响As2O3可减少U266细胞培养上清中VEGF蛋白的浓度,且随着药物剂量的增大其上清液VEGF蛋白浓度不断降低,呈明显的剂量依赖(P<0.05,图4)。但是考虑细胞增殖对VEGF分泌的影响,发现2 μmol/L As2O3不同处理时间组及2 μmol/L As2O3处理组与对照组比较,VEGF蛋白表达差别无统计学意义(P>0.05,图5,6)。通过RT?PCR方法检测发现,2 μmol/L As2O3处理不同时间并不影响U266细胞VEGF mRNA的表达(P>0.05,图7)。
3讨论
3.1As2O3与肿瘤近几年来,As2O3治疗各类恶性肿瘤是肿瘤研究的热点之一。国内外研究显示As2O3对胃癌、肝癌及肺癌等多种实体瘤细胞以及淋巴瘤、骨髓瘤等血液肿瘤细胞有作用[3?6]。笔者的研究结果也证实As2O3能抑制骨髓瘤细胞增殖,呈时间?剂量依赖性;并能诱导其凋亡,呈剂量依赖性,与国内外报道一致[6?9]。
3.2VEGF与多发性骨髓瘤关系VEGF是多发性骨髓瘤病理形成和临床特征产生的重要细胞因子。骨髓瘤细胞株和初发MM患者的骨髓瘤细胞均表达VEGF及其受体(VEGFR?1,?2)。VEGF通过自分泌和/或旁分泌作用途径激活PI3K/PKCα依赖的级联反应,激活Raf?1?MEK?ERK途径,上调Mcl?1和生存素,调节骨髓瘤细胞的生存、增殖及迁移,对于骨髓瘤细胞归巢到骨髓、在骨髓微环境中扩增、多药耐药的产生、释放到外周血均起着重要作用。此外,VEGF还可以通过抑制NF?ΚB活化,抑制树突状细胞的成熟,使得骨髓瘤细胞逃脱机体的免疫监视;激活ERK1/2,增加破骨细胞的骨重吸收活性和趋化性,参与MM骨病和高钙血症的形成;刺激内皮细胞和骨髓基质细胞分泌IL?6,调节骨髓瘤细胞的生存、增殖[3]。本实验发现,As2O3处理的U266细胞培养上清中VEGF蛋白总量明显减少,但考虑As2O3对U266细胞增殖的影响,笔者发现As2O3对U266细胞VEGF蛋白表达并没有影响。通过RT?PCR检测证实,As2O3并不影响U266细胞VEGF mRNA的表达。因此,笔者认为As2O3不影响单个U266细胞VEGF的表达,但是可通过抑制U266细胞增殖,诱导其凋亡,降低肿瘤负荷,从而减少细胞培养上清液VEGF的分泌量,减弱VEGF的病理生理作用,促进As2O3的抗骨髓瘤作用。同时,As2O3抑制骨髓瘤细胞增殖、诱导其凋亡的途径及机制是多样化的,有待更深入地研究。
【】
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