血清CagA抗体鉴定幽门螺杆菌高毒株感染的评价
【摘要】 目的评价通过检测血清CagA抗体鉴定幽门螺杆菌高毒株感染的可行性。方法采集福州地区临床门诊行胃镜检查的胃活检标本,行病理检查和幽门螺杆菌(Hp)培养;采集病人血清,PCR法检测分离所得的Hp cagA基因;EIA法测定血清CagA抗体,分析cagA基因的检出与消化性疾病的关系,比较CagA基因与CagA抗体的检测结果,评价应用CagA抗体检测Hp高毒株感染的可行性。结果分离获得80株Hp,其中54株检出cagA基因,阳性率67.50%。各病理类型胃病患者cagA基因阳性率:浅表性胃炎77.42%,萎缩性胃炎62.86%,胃溃疡58.33%,胃癌50.00%,各组间差别无统计学意义(P>0.05);CagA抗体阳性率55.00%,敏感度74.07%,特异度84.62%,约登指数58.69%,调整一致性77.68%。结论检测血清CagA抗体用于诊断高毒力Hp感染存在局限性。
【关键词】 螺杆菌 幽门 细胞毒素类 抗体 细菌 免疫酶技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起慢性胃炎、消化性溃疡等疾病的主要病因,并与胃癌、MALT淋巴瘤的发生密切相关。Hp感染呈全球分布,人群感染率高。Hp感染后是否导致炎症以及溃疡的发生与其毒力因子密切相关,进行高毒力菌株的鉴定对于临床诊断及是否需要进行Hp根除性具有极其重要的指导意义。cagA是Hp主要毒力基因之一,与慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌的发生密切相关[1]。CagA抗体的检测是否能够应用于临床检测高毒力菌株的感染,从而反映消化性疾病的发生及其严重程度,目前尚无定论。笔者采集胃活检标本,作病理检查和Hp培养,检测Hp cagA基因和患者血清CagA抗体,分析cagA基因的检出与消化性疾病的关系,评价应用CagA抗体检测Hp高毒株感染的可行性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本2005-2006年收集福建医科大学附属第一和附属协和医院门诊行胃镜检查患者活检胃组织标本和血清标本。活检标本取胃窦部黏膜组织,1份送病理室作病理检查,1份置于布氏培养液0.5 mL中用于细菌分离培养。外周静脉血5 mL离心收集血清,分装后-20 ℃保存备用。
1.1.2标准幽门螺杆菌菌株标准菌株Hp NCTC 11637(疾病预防控制中心传染病研究所)。
1.1.3Hp cagA和16s rRNA引物设计根据GenBank公布的Hp cagA和16s rRNA序列,经同源性分析,以Vector NTI 9.0软件设计cagA开放读码框架内引物CF/CR和16s rRNA引物16F/16R,引物由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列如下:
cagA CF:5’ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAG?
CGA 3’
CR:5’TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT 3’
16s rRNA 16F:5’GTCATGACGGGTATCC 3’
16R:5’ACTTCACCCCAGTCGCTG 3’
1.1.4主要试剂盒快速尿素酶检测试剂盒(三明三强生物化工有限公司)。CagA?Hp IgG EIA Kit试剂盒(上海晶莹生物技术有限公司)。
1.1.5主要仪器设备厌氧工作站(Bugbox?Microaerophilic System,英国Ruskinn公司)。
1.2 方法
1.2.1细菌分离培养及鉴定取胃镜活检组织用匀浆器磨碎,涂布于含5％脱纤维兔血的布氏培养基上,置于厌氧工作站中37 ℃微需氧饱和湿度环境(5%O2,10%CO2,85%N2)下培养3～5 d。培养产物经快速尿素酶试验、涂片染色镜检初步鉴定。
1.2.2模板DNA制备初步判断为幽门螺杆菌者,刮取细菌置灭菌双蒸水50 μL中,100 ℃水浴10 min,8 700 r/min离心5 min,取上清,-20 ℃保存备用。
1.2.3Hp临床分离菌株16s rRNA基因PCR鉴定将初步鉴定为幽门螺杆菌的临床分离株DNA进行16s rRNA基因PCR检测,阳性者确定为幽门螺杆菌。PCR反应体系:PCR反应总体积25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,上游引物16F 0.75 μL,下游引物16R 0.75 μL,模板5 μL,Pfu DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL,高压灭菌双蒸水15 μL。反应程序:94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min)×40→72 ℃ 5 min。
1.2.4Hp临床分离菌株cagA基因PCR检测PCR反应体系:PCR反应总体积25 μL,包括10×PCR缓冲液2.5 μL,dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,上游引物CF 0.75 μL,下游引物 CR 0.75 μL,模板DNA 5 μL,Pfu DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL,高压灭菌双蒸水15 μL。反应程序:94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min)×30→72 ℃ 5 min。
1.2.5血清CagA抗体测定酶免疫检测技术测定血清CagA抗体。血清样品处理与检测按照试剂盒使用方法专人操作。应用酶标仪,在450 nm波长测定血清样品及阳性、阴性对照D值,各血清样品CagA抗体浓度。
1.3统计学处理用SPSS for Windows 13.0软件,采用χ2检验比较样本率之间的差异,以P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1胃活检标本Hp的分离培养及鉴定分离培养的细菌,经快速尿素酶试验,涂片染色镜检和16s rRNA PCR鉴定,共分离出80株Hp。
2.2Hp临床分离株cagA基因检测80株临床分离的Hp中54株为cagA基因阳性,阳性率67.50 %。CagA阳性菌株中24例浅表性胃炎,22例萎缩性胃炎,7例消化性溃疡,2例胃癌。cagA基因检测结果及对应的病理诊断结果见表1。各组病理类型的cagA基因阳性率，经χ2检验P>0.05。表1各种病理类型胃病患者Hp cagA基因检测结果 cagA基因阳性为株数(%).
2.3血清CagA抗体检测与cagA基因检测CagA抗体阳性率55.00%(44/80),敏感度74.07%(40/54),特异度84.62%(22/26),约登指数(Youden's index)58.69%,调整一致性77.68%(表2)。表2CagA抗体与cagA基因检测结果表中数据为株数.
3讨论
3.1Hp高毒株感染与cagA基因的关系目前对于Hp感染的诊断可以分为两种:即侵入性检查和非侵入性检查,前者主要是通过胃镜取胃黏膜标本作快速尿素酶诊断、细菌培养、PCR和组织学检查;后者包括血清抗体的检测、尿素呼气试验、粪便抗原检测等。因侵入性检查具有创伤性,尤其不能被儿童所接受,故而非侵入性检查更多受到青睐[2]。但是上述非侵入性的检查方法(如尿素呼气试验、粪便抗原和血清UreB抗体检测)仅是对Hp感染进行诊断,不能对高毒株进行鉴定。
cagA和vacA是目前研究最多的Hp多态性毒力基因,根据Hp是否产生VacA和CagA蛋白将其分为Ⅰ型和Ⅱ型菌:Ⅰ型菌产生VacA和CagA蛋白,为高毒力菌株,与慢性胃炎、消化性溃疡等疾病的发生密切相关;Ⅱ型不产生CagA和VacA蛋白,为低毒力株[3]。cagA基因是Hp cag毒力岛的标志,研究发现具有cagA基因Hp感染者较无cagA基因Hp感染者有更明显的胃炎和胃上皮损伤。胃黏膜中IL?1α﹑IL?1 和IL?8表达更高,IL?8能引起中性粒细胞在胃黏膜中浸润,加重黏膜炎症反应的损伤程度,引起上皮结构丧失，继之发生萎缩和肠化生，最终为胃癌。然而,越来越多的流行病学调查发现,CagA阳性菌的感染率极高,在西方国家约占60％～80％[4]。亚洲感染率更高,我国有些地区甚至达到90%以上[5]。日本和韩国学者的报告显示，含cagA基因的Hp菌株在亚洲地区的存在与宿主的疾病种类无明显相关。Lazebnik 等研究提示，cagA+vacA s1 感染率高,很难确定其与疾病的关系[6]。本研究利用PCR方法调查福州地区80株临床门诊来源的幽门螺杆菌菌株cagA基因类型,结果在全部Hp菌株中cagA基因的阳性菌株为54株(阳性率67.50 %),不同严重程度的宿主胃病病理类型之间cagA基因阳性率差别无统计学意义,即cagA基因与消化性疾病的严重程度无相关性,也验证了上述观点。cagA基因及其编码产物的确切作用及其在Hp致病中的地位,尚需进一步的探讨。目前至少可以认为CagA可能是一种重要的毒性标记,但并非疾病的特异性标记。有学者认为Hp的cagA基因序列可能存在地理分布的差异，我国各地区Hp感染菌株是否亦存在上述差异,值得进一步研究。
3.2血清CagA基因检测对Hp高毒株感染诊断的意义目前检测血清CagA抗体是诊断高毒力Hp感染的常用方法。研究发现,具有cagA基因的Hp几乎都能表达CagA蛋白,并能产生可以测出的CagA抗体,血清CagA抗体阳性与Hp cagA基因存在非常密切的关系。但该方法始终存在敏感性和特异性不高的问题,其作为毒力菌株的鉴定方法值得商榷[7]。本课题组以往研究显示,检测56份Hp感染者血清CagA抗体,敏感度和特异度均小于72%[8]。本研究中,80株临床分离的Hp,检出cagA基因阳性率为67.50%,而CagA抗体检测阳性率只有55.00%,抗体检测的敏感度和特异度分别为74.07%和84.62%,约登指数58.69%,调整一致性77.68%,以上指标均偏低，显示检测血清CagA抗体用于诊断高毒力Hp感染存在局限性,不能准确反映患者感染的Hp毒力情况。考虑受如下因素影响:cagA基因具有高度多态性, 随地区、人群的改变具有不同的型别。CagA?Hp IgG EIA Kit试剂盒所采用的CagA抗原蛋白并不一定是PCR所检测到的cagA基因所编码的蛋白，应从胃内分离单一菌株,并对cagA基因分段测序。另外,血清学检测虽然可以在一定程度上反映CagA阳性菌株感染的情况,但同时也受机体的免疫状态以及IgG特性等诸多因素影响,如当机体免疫功能较低时可能出现假阴性的结果;血清IgG半衰期长,当机体内Hp清除,CagA蛋白抗原消失或cagA基因检测不到时,血清IgG仍可能保持高滴度水平,而形成假阳性结果。
以检测CagA来反映毒性Hp的感染情况,已不能很好地满足临床的需要,加上目前的检测试剂盒敏感性和特异性不甚理想,极大影响了临床上的广泛应用。而寻找新的检测指标,揭示更具特征性的毒力因子,将是有效诊断高毒力Hp感染的出路。
【】
/[1/]Simán J H,Engstrand L,Berglund G, et al. Helicobacter pylori and CagA seropositivity and its association with gastric and oesophageal carcinoma/[J/]. Scand J Gastroenterol, 2007,42(8):933?940.
/[2/]Iwanczak F,Pytrus T,Iwanczak B,et al. Assessment of selected tests in diagnosis of Helicobacter pylori infections/[J/]. Pol Merkuriusz Lek, 2005,19(109):52?56.
/[3/]Wen S,Velin D,Felley C P,et al. Expression of Helicobacter pylori virulence factors and associated expression profiles of inflammatory genes in the human gastric mucosa/[J/]. Infect Immun, 2007,75(11):5118?5126.
/[4/]Thjodleifsson B,Asbj?rnsdottir H,Sigurjonsdottir R B,et al. Seroprevalence of Helicobacter pylori and cagA antibodies in Iceland, Estonia and Sweden/[J/]. Scand J Infect Dis, 2007,39(8):683?689.
/[5/]朱永良,杜勤,钱可大,等. 幽门螺杆菌CagA C 端功能域特征及其生物学功能研究/[J/]. 中华消化杂志, 2004,24 (5):278?281.
/[6/]Lazebnik L B,Tsaregorodtseva T M,Serova T I,et al. Antibodies to Helicobacter pylori in gastric diseases/[J/]. Ter Arkh, 2006,78(2):15?19.
/[7/]Suriani R,Venturini I,Colozaa M. Helicobacter pylori antibodies(CagA and VacA) detection.The link between cancer and infection/[J/]. Minerva Gastroenterol Dietol, 2002,48(2):159?164.
/[8/]张静,陈月秀,佘菲菲,等. 幽门螺杆菌cagA M1＇基因表达抗原的纯化及应用/[J/]. 人兽共患病杂志, 2005,21(6):495?498.
