异鼠李素在碳糊电极上的伏安行为及其测定
【摘要】 目的研究异鼠李素在碳糊电极上的伏安行为,建立异鼠李素含量测定的新方法。方法采用循环伏安法检测异鼠李素在电极上的电化学行为,以差示脉冲伏安测定其含量。结果异鼠李素发生单、单质子的氧化还原反应,该反应为有吸附特征的可逆过程。在pH 4.0磷酸缓冲液中,氧化峰电流与异鼠李素浓度在2.0×10-7~3.0×10-6 mol/L呈良好的线性关系,检测限为2.5×10-8 mol/L。结论碳糊电极可有效消除样品中其他组分对异鼠李素测定的干扰,可用于实际样品的测定。
【关键词】 鼠李素 位测定法 电极
异鼠李素(isorhamnetin)是一种多羟基黄酮类化合物,为一些中草药的有效成分,具有较好的抗心肌缺氧、缺血、缓解心绞痛、抗心律失常、抗氧自由基、降低血清胆固醇等多种心血管效应[1?2]。近20年来只有少量种类的黄酮类化合物的电化学性质被研究和应用[3]。多羟基黄酮类在电分析领域的应用已经引起关注[4]。碳糊电极具有电位范围宽、制备方便、价格低廉等特点,在伏安法中得到广泛应用[5]。笔者研究在碳糊电极上伏安法直接测定异鼠李素的方法,探讨该化合物在碳糊电极上的伏安性质和电极反应机制,采用差示脉冲伏安法测定心达康片中黄酮的总含量。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器电化学分析仪(CHI660B,上海辰华仪器公司);采用三电极体系,工作电极为碳糊电极,对电极为铂丝电极,参比电极为Ag?AgCl电极;精密酸度计(pHS?3B型,上海雷磁仪器厂);医用数控超声波清洗器(KQ?250DE型,昆山市超声仪器有限公司);搅拌器(JB?1型,上海雷磁新泾仪器有限公司);电子分析天平(BS110S型,德国Sartorius公司)。
1.1.2试剂异鼠李素标准品(药品生物制品检定所),用无水乙醇配制成1.0×10-3 mol/L储备液,避光保存;磷酸缓冲液(PBS):由50 mmol/L NaH2PO4?Na2HPO4和20 mmol/L NaCl配制,用50 mmol/L H3PO4和NaOH溶液调至pH 2,3,4,5,6,7.4。所用试剂均为分析纯,实验用水为二蒸水。心达康片样品(四川雅达药业股份有限公司,批号:050503）,总黄酮标示量每片5 mg。
1.2方法
1.2.1制备碳糊电极参照[6],取石墨粉3 g于研钵中,按3∶1(g/g)比例加入液体石蜡,搅拌均匀,调成糊状,填入直径3 mm的聚四氟乙烯管中,充分压紧,另一端用铜棒引出。电极表面在称量纸上抛光,用蒸馏水淋洗,将电极置于0.1 mol/L H2SO4中于-0.5~1.4 V循环扫描20圈,蒸馏水淋洗备用。
1.2.2测定异鼠李素以磷酸盐缓冲液(pH 4.0)为测定底液,加入异鼠李素标准溶液10 μL,在电解池中通氮气5 min,除去溶解氧,开路搅拌富集2 min,静置10 s,扫描速度100 mV/s时,记录电位-0.2~0.8 V的循环伏安和差示脉冲曲线,测量氧化峰电流。
1.3判断标准可逆过程:正向电压扫描出现阴极峰,反向电压扫描出现阳极峰,且△Ep<59/n mV,Ipa/Ipc＝1;准可逆过程:正向电压扫描出现阴极峰,反向电压扫描出现阳极峰,且△Ep>59/n mV,Ipa/Ipc<1或>1;不可逆过程:正向电压扫描出现阴极峰,反向电压扫描不出现阳极峰[7]。
2结果
2.1异鼠李素在碳糊电极上的循环伏安特征在pH 4.0的PBS中出现一对氧化还原峰(图1),氧化峰电位(Epa)与还原峰(Epc)电位分别为0.371和0.315 V,△Ep=56 mV。Ipa/Ipc =6.418/7.102=0.904≈1,表明该电极反应为可逆过程。根据可逆过程的判断依据,可知该电极反应的电子转移数n≈1。由异鼠李素在碳糊电极上的循环图可得,该体系氧化峰的半峰宽为129 mV,由关系式W1/2=62.5/(1-α)n,可得电子转移系数α=0.516。
改变底液pH,随溶液pH值的增加氧化还原峰电位均负移,将低扫描速度下测得的氧化还原峰电位的平均值作为式量电位Eo,并将测得的Eo对溶液的pH作图。在pH 2.0~7.4范围内,Eo与pH呈良好的线性关系,得到斜率为-57.8 mV/pH的直线(图2)。该电极反应中电子的得失伴随质子转移,质子转移数与电子转移数的比值为1。
随扫描速度的增加,氧化峰电流和还原峰电流均明显增加(图3),在20~140 mV/s扫描速度范围内呈良好的线性关系,回归方程为Epa(V)=0.073 v(mV/s)+0.0817,相关系数为0.9992,表明异鼠李素在电极表面是吸附控制过程。当扫描速度过高时,充电电流增大,不利于峰电流的测定。在获得较大峰电流的同时又要防止充电电流过大,故选择扫描速度为100 mV/s。
2.2差示脉冲伏安法测定条件选择
2.2.1pH值溶液pH值对异鼠李素的峰电流存在显著影响,碱性条件下峰电流变小,酸性条件下峰
A:扫描速度(a→g依次为20,40,60,80,100,120,140 mV/s); B:扫描速度与峰电流的关系.
图3扫描速度对异鼠李素循环伏安图的影响
Fig 3CV curves of isorhamnetin on carbon paste electrode at the different scan rate
电流明显升高,且波形较好,灵敏度高,因此选择pH 4.0的PBS缓冲液作为支持电解质。
2.2.2富集时间按照1.2.2方法,比较开路静止富集和开路搅拌富集对峰电流的影响。在开路搅拌富集2 min后,峰电流最大且保持恒定,说明异鼠李素在电极表面的吸附达到饱和,选择开路搅拌富集2 min后测定。
2.2.3表面活性剂在测定体系中分别加入浓度均为1%(V/V)的阳离子型表面活性剂CTMAB,非离子型表面活性剂Tween80,阴离子型表面活性剂SDS各0.5 mL,异鼠李素Ipa均明显下降,其中,以加入阴离子型表面活性剂的下降最明显,进一步表明异鼠李素电极反应的吸附性质。分别配制不同浓度NaCl的PBS底液,同法测定异鼠李素的氧化峰电流,异鼠李素在碳糊电极上的电化学行为受离子强度的影响较小。
2.2.4干扰实验在含1.0×10-6 mol/L异鼠李素的测定条件下(相对误差±5％),20倍量的L?胱氨酸、D?L?α?氨基丙酸、50倍量咖啡因、L?谷氨酸,β?环糊精、葡萄糖、乳糖以及饱和淀粉水溶液等不干扰测定,即碳糊电极具有较好的选择性。
2.3线性范围及检出限以差示脉冲伏安法分别测定不同浓度异鼠李素标准溶液的氧化峰电流(图4A),以峰电流对异鼠李素的浓度作图,在2.0×10-7~3.0×10-6 mol/L峰电流Ipa与异鼠李素浓度(C)呈良好的线性关系(图4B),回归方程为Ipa(μA)=0.0377C(μmol/L)+0.9852,r=0.9962,检测限为2.5×10-8 mol/L。
2.4稳定性、精密度和回收率将新配制的溶液立即测定或放置一段时间后测定,其氧化峰电位和电流在2 h内无明显变化。对1.0×10-6 mol/L的异鼠李素溶液,按照1.2.2方法,连续测定10次,峰电流RSD=2.3%。在样品溶液中分别加入异鼠李素标准溶液10 μL,按照1.2.2方法测定并回收率,回收率范围为97.8%~104.8%,平均回收率为100.7%,RSD=1.3%。
2.5样品分析由于心达康片中含有异鼠李素、槲皮素、山奈素等黄酮类物质,在实验条件下这些物质具有相似的伏安特征。因此,本方法测得的是样品中黄酮的总含量。取心达康片样品10片,研细,精密称取细粉50 mg,置50 mL容量瓶中,加甲醇溶解,超声30 min,并稀释、定容至刻度,滤过,取续滤液作为样品溶液。以后按上述实验方法操作。心达康片样品每片黄酮总含量为4.97 mg,符合2005版药典规定。
3讨论
3.1电极过程机制由可逆电极反应的判断依据:△Ep=Epa-Epc=59/n,实验测得异鼠李素在碳糊电极上的△Ep为56 mV,可推算出n＝1.03,即转移数n为1。pH 2.0~7.4,异鼠李素式量电位（Eo）与pH呈良好的线性关系,得到斜率为-57.8 mV/pH的直线。根据0.0578＝0.059m/n(m为质子转移数),其中电子转移数n为1,因此质子转移数m也为1。该结果与异鼠李素分子结构中B环上的4'?羟基为电活性基团相符。一般认为在异鼠李素的4个羟基中,B环上的4'?羟基供电子基团具有最高的电活性[8],能够在较低的电势下被氧化并显示较高的峰电流。因此可推断异鼠李素在碳糊电极上的反应为单质子、单电子的可逆过程,其氧化反应可表示为:
3.2异鼠李素在碳糊电极上的伏安行为及特点碳糊电极具有电位范围宽、制备方便、价格低廉等特点,在伏安法中得到广泛应用,笔者研究在碳糊电极上伏安法直接测定异鼠李素的方法,并探讨异鼠李素在碳糊电极上的伏安性质和电极反应机制。在选定的最佳条件下,异鼠李素产生一对可逆的氧化还原峰,故此方法可用于研究该化合物在碳糊电极上的电化学行为,由此建立其含量测定的新方法。与紫外分光光度法相比,该方法具有所用样品量少、灵敏度高、检出限低、反应快速、稳定性好和操作简单等特点,已成功用于实际样品分析,结果满意。
【】
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