血管内皮细胞体外三维培养方法的比较
【摘要】 目的比较不同方法进行脐静脉内皮细胞体外三维培养形成三维血管状结构的差异。方法采用表面培养法与混合培养法行脐静脉内皮细胞体外三维培养,观察形成的三维管网状结构。结果表面培养法:细胞生长快,管状结构形成多,细胞分支连接形成复杂的三维网状结构;混合培养法:细胞生长缓慢,管状结构形成少,出现细胞连接形成的细胞索与三维网状结构数量较少。两种培养方法形成的血管样结构的数量与长度明显不同。结论表面培养法体外血管三维培养,具有操作简便、细胞生长快、三维血管结构形成数量多、血管结构复杂等特点,适用于血管生成影响因素的实验研究。
【关键词】 内皮细胞 内皮 血管 细胞 培养的 脐静脉 新生血管化 病理性
血管生成即由原有血管出芽生长形成新生血管的过程。对于许多生理性过程(如胚胎发育、创伤修复)以及病理性过程(如动脉硬化、肿瘤发生),尤其是在肿瘤的发生与侵袭转移等的一系列病理过程中,新生血管起了相当重要的作用[1]。新生的毛细血管既为肿瘤生长提供营养,又为肿瘤转移准备条件。体外血管三维培养方法可使细胞呈立体生长,更接近于体内生长模式,为血管生长模拟了类似于体内的三维空间,诱导细胞出芽、增生、迁移或分化等一系列变化,对于评估各种因素对血管生成的影响具有实际应用价值。笔者采用表面培养法和混合培养法,在三维凝胶培养基中进行脐静脉内皮细胞的体外三维培养,比较二种体外培养方法在形成三维血管结构的长度和数量,以及形成血管网的复杂性等方面的差异,为针对肿瘤性血管生成的肿瘤方法提供实验方法学方面的依据。
1材料与方法
1.1材料主要试剂:DMEM高糖培养基、PBS缓冲液与0.25%胰蛋白酶(美国 Gibco公司),克隆胎牛血清(FBS,奥地利 PAA公司),支原体抗生素Plasmocin(美国 Invivogen公司),内皮生长支持物(ECGS,美国 Sigma公司),抗第Ⅷ因子抗体、抗CD31抗体、抗CD34抗体及相关抗原免疫染色试剂(美国 Santa Cruz公司),三维细胞培养基试剂盒(美国 Chemicon公司),青霉素、链霉素、两性霉素(华北制药集团)。主要仪器:水套式CO2培养箱(3110型,美国 Thermo Forma公司),倒置相差显微镜(Ⅸ?71型,日本 Olympus公司),低速冷冻大容量离心机(DL?4000B型,上海安亭仪器厂),垂直流超净工作台(江苏苏净集团安泰公司)。
1.2方法
1.2.1人脐静脉内皮细胞分离、培养与鉴定酶灌注法分离人脐静脉内皮细胞:健康产妇分娩后立即无菌操作取新生儿脐带20 cm左右,以含有适量青霉素、链霉素、两性霉素的PBS冲洗脐静脉腔,向脐静脉腔内灌注0.25%胰酶,至脐静脉充盈,以血管钳夹闭脐静脉腔,37 ℃孵育7 min。PBS冲洗脐静脉腔并收集流出液,FBS终止胰蛋白酶的消化作用,离心收集细胞,加入含20%FBS及适量青霉素、链霉素、两性霉素的DMEM培养基,37 ℃培养箱中静置培养,24 h后更换培养基,去除未贴壁的悬浮细胞。隔天更换培养基,至贴壁细胞70%~80%融合时,消化传代,取3~4代用于三维培养。
1.2.2三维培养胶原溶液制备按照试剂盒说明书,在无菌EP管中加入胶原溶液2 mL,然后加入5×DMEM 0.5 mL,小心混匀,避免产生气泡,加入平衡液25 μL,混匀,并将配制好的胶原溶液置于冰上备用。
1.2.3脐静脉内皮细胞体外三维培养
1.2.3.1表面培养法向96孔培养板的每一个培养孔内加入配制好的胶原凝胶溶液100 μL,立即将培养板置37 ℃培养箱温育60 min,使胶原溶液聚合形成固体凝胶。将培养传代3~4代的脐静脉内皮细胞自培养瓶壁消化,并反复吹打形成单细胞悬液。将脐静脉内皮细胞以每孔约5×104的密度接种于胶原凝胶表面。1 h后倒置相差显微镜下观察凝胶表面的细胞生长状况,待细胞贴壁达到70%~80%融合时,更换培养基为DMEM+20%FBS+ECGS 200 μg/mL。培养24 h后,倒置相差显微镜下每个培养孔随机选择若干个视野,记录每个视野
A:表面培养法; B:混合培养法; 1:接种12 h(×200); 2:接种24 h(×200); 3:接种24 h凝胶垂直切片(H?E×100).
A1:内皮细胞迁移连接,形成细胞索样结构,数量较多,出现连接沟通; A2:细胞索样结构趋复杂,细胞索分支沟通连接形成复杂的网状结构; A3:,内皮细胞索形成管网状结构. B1:细胞索样结构数量较少; B2:细胞索数量与网络分支较少; B3:少量细胞索结构,罕见血管网结构.
下生长的内皮细胞管的长度和管状结构数目;而后将胶原凝胶进行4％甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片等一系列处理,显微镜下观察脐静脉内皮细胞在胶原凝胶中的生长情况。
1.2.3.2混合培养法将培养传代3~4代的脐静脉内皮细胞自培养瓶壁消化,吹打形成单细胞悬液。将脐静脉内皮细胞以1×106 mL-1的浓度与胶原溶液混合,小心吹打,形成单细胞悬液,避免产生气泡。向96孔培养板的每个孔内滴加脐静脉内皮细胞胶原溶液混合液100 μL,避免产生气泡。立即将培养板置37 ℃培养箱60 min,使胶原溶液聚合形成固体凝胶。向凝胶表面添加培养基DMEM+20%FBS+ECGS 200 μg/mL。后续步骤同1.2.3.1。
1.2.4统计学处理数据以x±s表示,采用PEMS 3.1统计软件进行两独立样本均数比较。
2结果
2.1细胞鉴定取少许贴壁生长细胞作免疫组织化学染色鉴定,CD31、CD34、Ⅷ因子染色均为阳性,证实该细胞为脐静脉内皮细胞(图1)。
2.2形态学观察
2.2.1表面培养法接种1 h后脐静脉内皮细胞在胶原凝胶表面发生融合生长,逐渐从凝胶表面向凝胶内迁移,最早于接种6 h后即可观察到少量由细胞迁移连接形成的细胞索结构,12 h后细胞索结构数量增多,并且相互之间出现连接沟通,随着时间推移,细胞索结构越趋复杂,24 h左右细胞索的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构,3 d后凝胶内细胞仍生长旺盛。将培养24 h胶原凝胶固定包埋切片,光学显微镜下可见内皮细胞索形成的血管状结构。
2.2.2混合培养法细胞在凝胶内生长,12 h后可观察到由内皮细胞连接形成的细胞索结构,但数量较少,24 h左右细胞索分支间相互沟通连接形成状结构,与表面培养法形成的网络状结构相比,细胞索数量较少,网络分支也较少,48 h左右凝胶内的细胞逐渐出现凋亡现象,血管分支结构渐崩解。将培养24 h的胶原凝胶固定包埋切片,光学显微镜下可见由内皮细胞连接形成的细胞索结构,而由细胞索沟通连接形成的血管网结构相对少见(图2)。
2.3血管样结构长度和数量表面培养法与混合培养法分别培养24 h后,前者形成的血管样结构的长度和数量为(2.06±0.29)mm和(11.43±1.43),后者为(1.18±0.11)mm和(5.42±0.77),差别均有统计学意义(P<0.05)。
3讨论
内皮细胞在三维培养体系与二维培养体系中的生物学行为存在显著差异[2],三维培养体系中内皮细胞的生长更类似于体内血管生成。血管生成对于许多生理性过程和病理性过程,尤其是在肿瘤的发生与侵袭转移等一系列病理过程中,具有相当重要的作用。内皮细胞体外三维培养方法多种多样,国内外学者经过20余年的研究,发展出了表面培养法、混合培养法、微载体培养法以及基质内细胞聚集体侵袭法(RIMAC)、磁标记法等方法[3?7],并且应用这些方法,在血管生成促进因子、抑制因子以及各种血管生成影响因素等方面进行大量的研究。
本研究比较表面培养法与混合培养法脐静脉内皮细胞体外三维培养,两种培养方法均能在胶原凝胶中观察到细胞索样结构以及由细胞索连接形成的复杂管网样结构,但使用前者最早于培养6 h可以观察到细胞索结构,同时在胶原凝胶中形成三维管状结构的数量明显多于后者,长度明显大于后者,且所形成的管状结构的复杂性更甚于后者。在实验操作方面,表面培养法将内皮细胞接种于已凝固的胶原凝胶表面,操作过程简便易行,不必将细胞混悬于胶原溶液中,避免了因混悬内皮细胞而出现的凝胶气泡的现象,同时避免了由于实验操作机械损伤内皮细胞而降低细胞活力,因此不影响细胞在三维凝胶中的伸展、迁移等一系列生物学过程,不影响实验结果的观察,具有操作简便、方便观察等特点。
与混合培养法相比较,表面培养法在内皮细胞的体外三维培养方面还具有管状结构数量多、结构复杂、细胞生存期长等特点,更适用于对血管生成促进因子、抑制因子以及各种血管生成影响因素等方面的研究。
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