大鼠离体心脏缺血?再灌注过程的功能变化
【摘要】 目的建立大鼠离体心脏缺血?再灌注(I/R)损伤模型,观察I/R过程心脏舒缩功能与冠脉流量变化。方法大鼠离体心脏采用Langendorff法灌流,对照组(n=8)心脏连续灌流80 min;I/R组(n=8)心脏缺血40 min再灌注40 min。实验过程实时动态检测心率(min-1)、心肌收缩幅度(g)与最大收缩速度(dT/dtmax,g/ms)、最大舒张速度(?dT/dtmax,g/ms)、心肌静息张力(g)、冠脉流量(液滴,min-1)。结果与对照组比较,I/R组心脏缺血后心搏停止，20 min后心肌静息张力上升(P<0.05);再灌注后心肌张力仍高;心搏恢复但心率、心脏收缩幅度、最大收缩速度、最大舒张速度均降低(P<0.05~0.001);再复灌注初冠脉流量恢复正常,10 min后呈下降性变化(P<0.05~0.001)。结论大鼠离体心脏缺血40 min再灌注40 min导致I/R损伤,该模型制备及功能评价方法简便可靠。
【关键词】 心脏 缺血?心肌再灌注损伤 收缩 舒张期 冠脉循环 病模型 物
缺血?再灌注(I/R)损伤是导致心脏病变的常见原因。建立简便可靠的心脏I/R损伤模型及评价指标,探讨心脏I/R损伤病变、机制及防治为人们所关注。笔者采用大鼠离体心脏缺血40 min再灌注40 min建立I/R损伤模型,观察I/R过程心脏功能变化规律,为该模型应用提供实验依据。
1材料和方法
1.1动物雄性SD大鼠16只,体质量250~300g[福建医科大学实验动物中心,合格证号SCXK(闽)2004?0002]。
1.2方法
1.2.1大鼠离体心脏灌流[1]术前30 min腹腔注射肝素25 mg/kg,术时腹腔注射20%氨基甲酸乙酯3 mL/kg,快速开胸取心置冰洛氏液中修剪,Langendorff法灌流离体心脏,灌流液采用氧饱和的37 ℃修正洛氏液,成分为(g/L):NaCl 9.0,KCl 0.42,CaCl2 0.24,NaHCO3 0.15,葡萄糖2.5。pH 7.4,灌注压70 cmH2O。
1.2.2心率、心脏舒缩力、冠脉流量测定[1]带系线的蛙心夹夹少许心尖组织,系线通过滑轮转向后与肌张力传感器相连。冠脉流出液由漏斗收集,滴落时与液滴换能器两电极接触。张力传感器、液滴换能器输出的心脏舒缩力、液滴信号由生物机能实验系统(BL?420E,成都泰盟科技有限公司)记录。调节系线松紧度,使心脏前负荷为3 g。灌流20 min后采集心搏、冠脉流出液液滴曲线(基础值)。实验过程每隔10 min采集心搏、流量曲线1 min。测量各时点心率(min-1)、心脏收缩幅值(g)、最大收缩速度(dT/dtmax,g/ms)、心肌舒张力(g)、最大舒张速度(?dT/dtmax,g/ms)及冠脉流量(min-1)。
1.2.3分组对照组心脏连续灌流80 min;I/R组心脏缺血(停止灌流)40 min再灌注(恢复正常灌流)40 min[2]。
1.3统计学处理数据以配对资料各时点值与基础值比值的x±s表示。两组各时点比值采用两均数t检验,P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1心搏、冠脉流量变化对照组心脏连续灌流80 min,其心率、收缩幅度、冠脉流量维持稳定,心肌静息张力下降(图1A)。I/R组心脏缺血40 min心搏停止,心肌静息张力升高;再灌注后心搏恢复,但搏动弱,冠脉流量减少(图1B)。
2.2对心率的影响对照组心脏灌流过程心率稳定;I/R组心脏缺血后心搏停止,再灌注后心搏恢复,但心率低于对照组(P<0.05,图2)。
2.3对心脏收缩功能的影响对照组收缩幅度、最大收缩速度维持稳定。I/R组再灌注后收缩幅度、最大收缩速度均低于对照组(P<0.05~0.001),表明缺血40 min再灌注心脏收缩功能低下(图3)。
2.4对心脏舒张功能的影响对照组心脏灌流过程心肌张力下降;最大舒张速度灌流初60 min增快(与稳定值比较,P<0.05),之后维持稳定,说明离体心脏连续灌流80 min舒张功能维持正常。I/R组心脏缺血20 min心肌张力维持稳定,之后开始升高,缺血40 min升高明显(P<0.05);再灌注后心脏仍处于高张力状态(P<0.05),最大舒张速度也明显低于对照组(P<0.05~0.001),表明缺血40 min?再灌注40 min造成心脏舒张功能不良(图4)。
2.5对心脏冠脉流量的影响对照组冠脉流量稳定,I/R组再灌注初始10 min冠脉流量恢复接近正常(P>0.05),之后持续性下降(P<0.05~0.001),说明再灌注导致冠脉损伤流量减少,提示再灌注后冠脉流量进行性下降是本模型心脏再灌注损伤的征象(图5)。
2.6离体心脏标本观察实验结束剪开左心室观察,对照组心肌温暖柔软,I/R组心肌冰凉挛缩;整体标本状态对照组心脏张力低、冠脉循环良好,I/R组心脏张力高、冠脉循环差。
3讨论
3.1离体心脏I/R损伤模型研究心脏I/R损伤常用整体动物或离体心脏。采用离体心脏可避免整体神经体液及血管等因素对心脏功能影响,便于观察干预因素对心脏的直接效应。报道,离体心脏制备I/R损伤的方法有心脏稳定灌流后通过减少或完全停止灌流或改用充氮气的灌流液灌流,造成心肌一定程度缺氧或缺血损伤后,再恢复正常灌流[2]。本研究采用心脏稳定灌流20 min后完全停止灌流40 min造成心肌一定程度损伤再恢复正常灌流,该I/R方法简便易行。
已有研究表明,离体灌流条件下心脏舒缩功能可稳定2 h,之后呈下降性变化[1]。临床体外循环心脏手术时每30 min灌注心脏停搏液1次以保护缺血心脏。文献也报道,冠脉阻断20 min以内,缺血心脏功能可恢复正常;超过20 min则导致心肌不可逆坏死[3]。因此,为造成一定程度的心脏损伤并使I/R全程在2 h内完成,本研究I/R时间为缺血40 min再灌注40 min。
3.2I/R过程心脏功能动态变化
3.2.1收缩功能低下心脏收缩的力学特征(心率、心肌收缩力与收缩速度)决定心泵功能[4]。本研究显示,心脏缺血40 min再灌注,心率下降,心肌收缩幅度、最大收缩速度明显低下,提示心脏I/R后收缩功能低下。收缩功能低下是心脏I/R损伤的主要表现。
3.2.2舒张功能不良心脏舒张功能决定心脏充盈,也是影响心泵功能的重要因素。研究表明,各种感染性和非感染性(包括缺血性)心脏病变多是先表现舒张功能下降,随病情进展收缩功能也下降[5?6],说明心脏舒张功能不良是心肌损伤的早期表现。然而,较之收缩功能,心脏舒张功能不显著,临床也不易定量检测,故较少受重视。虽然目前超声心动图和核心脏病学技术已可定量观察病人心室舒张功能变化[7?8],但动物实验尚不便采用。离体心脏实验模型已广泛应用于心脏研究领域,包括用于研究心脏I/R损伤,但I/R过程反映心脏舒张功能的心脏张力变化尚无观察报道。
本研究动态定量测定I/R过程心脏静息张力变化,结果表明,缺血20 min心脏静息张力维持稳定,之后明显升高;再灌注后心脏张力仍高,最大舒张速度也下降,提示心脏舒张不良[9]。心肌高张力说明心肌状态不良,本研究表明缺血心脏静息张力可维持稳定20 min,该时限与文献报道的心肌安全缺血时限相一致[3]。因此,笔者认为心脏静息张力升高是反映心肌不可逆损伤的敏感的功能指标,值得采用;此外,本研究检测离体心脏舒张功能的方法简便易行。
3.2.3再灌注后冠脉流量进行性下降冠脉流量与冠脉流阻和灌注压有关。本研究离体心脏采用恒压灌流,故冠脉流量下降提示冠脉流阻增加。心脏缺血40 min再灌注后冠脉流量进行性下降,说明再灌注导致冠脉流阻进行性增加,这可能是再灌注加重缺血心肌损伤、细胞水肿造成冠脉受压所致。因此,笔者认为,缺血心脏再灌注后冠脉流量进行性下降是心脏再灌注损伤的主要表现。
大鼠离体心脏缺血40 min再灌注40 min可造成I/R损伤,功能变化包括舒缩能力低下、静息张力增高与冠脉流量下降。其中,心脏静息张力升高可反映心肌损伤程度,再灌注后冠脉流量进行性下降是心脏再灌注损伤的主要表现。本方法制备离体心脏I/R模型及实时动态检测心功能变化评价I/R损伤,可靠易行,值得推广应用。
【文献】
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