龈下刮治前后不同牙周状态龈下菌斑中HCMV病毒的检测
【摘要】 目的探讨人类巨细胞病毒（HCMV）感染与慢性牙周炎（CP）病变程度的关系，及龈下刮治对巨细胞病毒的表达影响。方法采用PCR方法检测45例CP患者龈下刮治前后其牙龈炎部位、牙周炎活动部位和牙周炎静止部位的HCMV检出率。结果龈下刮治前牙龈炎部位、牙周炎静止部位和活动部位HCMV的感染率分别为17%（17/100）、19.32%(17/88)和37.5%(42/112)，牙周炎活动部位的HCMV阳性率明显多于牙周炎静止部位和轻度龈炎部位（P<0.01）。龈下刮治后1周，HCMV阳性率明显下降，4周后又恢复到基线水准。结论HCMV感染与CP特别是牙周炎的活动性有密切关系。龈下刮治不能长期有效地抑制HCMV病毒的表达。
【关键词】 巨细胞病毒 巨细胞病毒感染 慢性病 牙周炎 牙龈下刮治术
慢性牙周炎(chronic periodontitis CP)是一种口腔常见的感染性疾病，但其发病机制至今尚未完全阐明。细菌被认为是牙周炎最主要的致病因素,但细菌致病学说并不能很好地解释牙周病的部位特异性以及间断爆发性[1]。近年来，各种PCR技术成为病毒核酸检测的特异、敏感的方法，为研究病毒在牙周病发病中的作用提供了帮助。初步研究表明人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）可能与局限性青少年牙周炎、急性坏死溃疡性龈炎的发生具有相关性[2?4]。本研究采用PCR方法检测CP患者不同牙周状态及这些位点经常规的牙周刮治前后HCMV的检出率，探讨HCMV病毒与CP的相关性。
1对象与方法
1.1对象病例选自2004年1月～2005年1月门诊就诊的初诊病人。病例的纳入标准为：（1）被临床诊断为牙周病患者，CP活动部位的判断标准为：牙周袋深度（pocket depth，PD）≥5 mm，附着丧失(attachment loss，AL)≥2 mm，探诊出血为阳性，牙龈指数≥2。CP静止部位的判断标准为：PD≥5 mm，AL≥2 mm，探诊出血为阴性，牙龈指数0～1。诊断牙龈炎的标准是患者牙龈变红、水肿或出血，但无AL，X线检查无牙槽骨的吸收[1]。（2）就诊前3个月未作牙周。（3）全身健康，无糖尿病、心血管等系统性疾病，近1个月内未服用抗菌素，妇女未妊娠。（4）口内的余牙≥20个。本组符合条件的CP患者45例，男性21例，女性24例，年龄（44±8.62）岁（25～72岁）。
1.2方法
1.2.1标本采集采样牙用消毒棉球将牙齿的龈上菌斑去除，吹干、棉卷隔湿，每个位点用3根消毒的纸尖插入牙周袋底30 s，放入装有200 μL TE缓冲液EP管内，转移置于-70 ℃保存。每位牙周炎患者均分别采取4个牙（前后牙各2颗）的近中和（或）远中牙周袋位点，记录每个采样位点的牙周袋的深度和牙龈指数，同时采用超声和手工器械进行常规的牙周刮治和根面平整，1周及4周后再次复诊采集同一位点的标本。
1.2.2DNA提取采用中山医科大学达安基因股份有限公司提供的病毒DNA提纯试剂盒制备上述患者标本中的DNA，采用加热煮沸法，具体步骤见试剂盒说明书，取2μL上清液作PCR反应。
1.2.3HCMV检测采用中山医科大学达安基因股份有限公司提供的巨细胞病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒进行检测。具体步骤如下：取待测样品和HCMV阳性、阴性标准品各2μL加入专用毛细管中, 8 000 r/min离心2 min，倒置10 s后，放入全自动荧光PCR扩增仪（Roche LighterCycler2.0,瑞士），设置PCR扩增反应循环参数为：预变性2 min→93 ℃ 45 s→55 ℃ 45 s，做40个循环。反应结束后，调整荧光记数值，读取仪器自动分析结果。40个循环内凡是出现典型的扩增荧光曲线者为阳性，未出现扩增荧光曲线为阴性。
1.3统计学处理检出率采用χ2检验。
2结果
对45名CP患者牙周刮治前牙周炎活动部位、牙周炎静止部位和轻度龈炎部位共300个位点进行HCMV检测，阳性率分别为17％(17/100)、19.32％(17/88)和37.5%(42/112)；刮治后1周和4周时，再次对刮治前17个HCMV阳性的牙龈炎部位与17个HCMV阳性的牙周炎静止部位及42个HCMV阳性的牙周炎活动部位进行检测（表1）。结果表明，刮治后1周HCMV阳性例数明显减少，但4周后又基本恢复到基线水平，即龈下刮治和根面平整对龈下菌斑中病毒的表达没有长久的影响效果。表145例慢性牙周炎患者龈下刮治前后不同牙周位点的人巨细胞病毒检出率
3讨论
病毒是细胞的专性寄生物，可以直接破坏细胞，并且感染病毒后，可无症状地长期携带，在一定条件下爆发，引起症状，急性期过后又可以潜伏。病毒潜伏与复发的模式与牙周病有静止期和活动期、间断爆发有相似性，因而受到学者的关注[5?6]。HCMV作为人类疱疹病毒的一种，普遍寄生于人类，它的活化与宿主免疫功能状态有密切相关，当机体的免疫功能受到严重抑制时，HCMV的临床感染明显增加。但是，HCMV的血清的抗体检测率在人群中有随年龄增大的趋势[3]。为了排除年龄因素对HCMV检测率的影响，本研究采取同一患者的不同牙周状态取样，结果显示，牙周炎活动部位龈下菌斑的HCMV阳性率明显高于牙周炎静止部位及牙龈炎部位的龈下菌斑中的HCMV的检出率（P<0.01），因此推测HCMV感染与CP特别是牙周炎的活动性有密切的相关性。Slots的进一步研究显示，HCMV主要通过感染牙周单核巨噬细胞，影响其功能和作用，引发牙周致病菌过度增殖，造成牙槽骨的吸收等牙周组织的损害[7?8]。
龈下刮治和根面平整是牙周基础中一项重要而关键的措施，通过刮治可使牙龈炎症进一步减轻或消退，牙周袋变浅或消失。龈下刮治能否减少牙周袋中的病毒表达，这是本研究的另一目的。结果显示，刮治后1周，牙周袋中的HCMV表达明显减少，然而4周后又基本恢复正常表达水平。可能是去除了龈下菌斑和结石能暂时性降低或抑制龈沟液中受病毒感染的炎症细胞的增殖，使之低于PCR检测所要求的最少10到100病毒基因组的量，PCR无法检测出，而治疗1个月后感染病毒的炎症细胞重新大量增殖进入，得以再次被检测出。Hanookai等在探讨人类疱疹病毒与三染色体性牙周炎的关系中也发现龈下刮治并不能减少牙周袋内的疱疹病毒，但可减少牙龈卟啉菌等厌氧菌的比率，表明龈下刮治可减少袋内的厌氧菌，但对病毒无效[9]。
本研究提示，HCMV与牙周病的活动性存在一定的关联，但究竟是HCMV引起了牙周病还是牙周病激活了HCMV导致二重感染，两者之间的因果关系还有待于进一步研究。另外，龈下刮治等基础治疗并不能有效减少龈下菌斑中的病毒感染，需寻找更加有效的治疗手段。
【】
/[1/]曹采方. 牙周病学/[M/]. 北京:人民卫生出版社, 2000:29?64.
/[2/]陈铁楼,周以钧,吴织芬. 疱疹病毒与牙周病/[J/]. 牙体牙髓牙周病学杂志, 2004,14(1):43?48.
/[3/]Slots J,Contreras A. Herpesviruses: a unifying causative factor in periodontitis/[J/]. Oral Microbiol Immunol, 2000,15(1):277?280.
/[4/]Chen L L,Sun W L,Yan J,et al. Correlation between infection of different glycoprotein B genetypes of human cytomegalovirus and human chronic periodontitis/[J/]. Chin J Stomatol, 2006,41(1):212?215.
/[5/]Parra B,Slots J. Dection of human viruses in periodontal pockets using polymerase chain reaction/[J/]. Microbiol Immunol, 1996,11(1):289?295.
/[6/]Kubar A,Saygun I,Ozdemir A,et al. Real?time polymerase chain reaction quatification of human cytomegalovirus and Epstein?barr virus in periodontal pockets and the adjacent gingival of periodontitis lesions/[J/]. J Periodontal Res, 2005,40(1):97?104.
/[7/]Conteras A,Nowzari H,Slots J. Hherpesviruses in periodontal pocket and gingival tissue specimens/[J/]. Oral Microbial Immunol, 2000,15(1):15?18.
/[8/]Slots J,Kamma J J,Sugar C. The herpervirus?Porphyromonas gingivalis?periodontitis axis/[J/]. J Periodontal Res, 2003,98(2):318?325.
/[9/]Hanookai D,Nowzari H,Conteras A,et al. Herpesviruses and periodontopathic bacteria in trisomy 21 periodontitis/[J/]. J Periodontol, 2000,71(3):376?383.
