脑型肌酸激酶同工酶测定在非心源性疾病的应用
【摘要】 目的探讨脑型肌酸激酶同工酶(CK?BB)在肿瘤、自身免疫性疾病的筛查以及器官损伤定位中的意义。方法免疫抑制法检测血清标本心肌型肌酸激酶同工酶(CK?MB)、肌酸激酶(CK)活性,二者比值。随机选取CK?MB/CK>50%的非心源性疾病的血清标本90份及30份对照血清,用CK同工酶琼脂糖凝胶电泳进行分离、鉴定。结果血清CK?MB假性增高的标本多见于肿瘤、自身免疫病,经电泳分离及可见光扫描后,肿瘤和自身免疫性疾病组的CK?BB含量明显高于对照组,差别具有统计学意义(P<0.01),血清CK?BB增高情况与其在组织器官中的分布相符。结论血清CK?BB的检测在肿瘤、自身免疫性疾病的辅助诊断以及器官损伤定位中具有重要意义。
【关键词】 脑型肌酸激酶
血清肌酸激酶(CK)及其同工酶的检测是诊断急性心肌梗死(AMI)最具有价值的生化指标之一[1?2],然而由于方法学的不完善以及其他可引起脑型肌酸激酶同工酶(CK?BB)升高的因素,临床上常出现所检测的CK?MB活性假性增高的现象,甚至还会出现CK?MB活性高于或相当于总CK活性的情况,而且这些患者多为非心源性疾病,如恶性肿瘤、脑出血、自身免疫性疾病、一氧化碳中毒及其他富含CK?BB的组织器官损伤等,因此进一步检测这些患者血清中CK?BB含量具有重要意义。笔者采用免疫抑制法测定血清CK?MB,筛选CK?MB/CK>50%的标本,进一步以CK同工酶琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定,并经可见光扫描进行定量分析,报告如下。
1对象和方法
1.1对象2005年3~5月住院病人血清标本4 000份,采用免疫抑制法测试从中挑出CK?MB/CK>50%的血清标本90份(其中肿瘤组51例,自身免疫病组28例,其他疾病组11例),并经心电图和心脏彩超检查排除心脏严重疾患。其中男性51例,女性39例,年龄(48±15)岁(6~80岁)。对照血清标本30份,均为本院健康体检者(非孕),年龄(45±11)岁(20~76岁)。肿瘤组、自身免疫病组、其他疾病组和对照组的年龄、性别经统计学处理差别无统计学意义。
1.2仪器及试剂全自动生化分析仪(AU?2700,日本Olympus公司),SPIFE2000电泳仪及EDC全自动扫描仪(美国GE公司)。CK试剂盒(中生北控生物科技公司);CK?MB试剂盒(北京九强生物技术有限公司);SPIFE CK同工酶试剂盒(美国Helena公司),包括SPIFE CK同工酶凝胶片(10个),SPIFE CK同工酶试剂(20×1.5 mL),SPIFE CK同工酶稀释液(2×0.2 mL),REP滤纸C(10片),枸橼酸脱色剂(1包)。
1.3方法
1.3.1总CK和CK?MB活性测定采用全自动生化分析仪检测,并记录CK与CK?MB的测定值。
1.3.2CK同工酶琼脂糖凝胶电泳加样:在100 μL标本中加入的SPIFE CK激活剂1 μL,混合并在室温下放置10 min,加入预先处理过的标本17 μL于样品槽内。电泳:在AMP/MOPSO缓冲液浸泡的琼脂糖凝胶上,13 ℃ 750 V电压下电泳4.5 min。加酶试剂:用同工酶稀释液1.5 mL复溶1瓶CK同工酶试剂,颠倒混匀,加入底物150 μL,将其倒在凝胶片的阳极侧,使试剂均匀平铺于凝胶片表面。孵育:在45 ℃下孵育20 min。脱色与烘干:0.3%枸橼酸脱色剂脱色5 min,于63 ℃下烘干30 min。EDC可见光定位扫描并记录CK?BB、CK?MB的值及一些异常的条带。
1.3.3CK同工酶琼脂糖凝胶电泳法试剂可靠性验证试验对CK同工酶电泳试剂和CK?MB试剂(中生公司和九强公司)进行可比性分析。依据
1/2 CK?MB%(电泳法)+CK?BB%(电泳法)≈1/2CK?MB/CK(免疫抑制法)
经过120份标本验证CK同工酶电泳法与免疫抑制法所测得B亚基的百分比大致相等。
1.4统计学处理计数资料以x±s表示,采用t检验。
2结果
2.1CK同工酶电泳图谱肿瘤患者与对照组血清CK同工酶电泳图谱比较见图1。
2.2EDC可见光扫描图像肿瘤患者血清CK?BB成分明显增多(图2)。
2.3免疫抑制法检测CK?MB/CK>50%的90份标本中,肿瘤组51份占56.7%,自身免疫病组28份占31.1%,其他疾病组11份占12.2%。经CK同工酶电泳分离后,CK?BB测定结果见表1。表1各疾病组的CK?BB水平
2.490份标本中CK?BB的组织含量>60%标本43份,<50%标本29份,经CK同工酶电泳所得CK?BB的测量值分别为[(26.76±8.56) vs (19.28±6.32),P<0.01]。
3讨论
免疫抑制法测定CK?MB活性的原理是,通过抗CK?M抗体抑制M亚基的活性,测定B亚基的活性,正常血清中CK?BB含量极微[3],用一般的方法检测不出,故将结果乘以2便可大致代表CK?MB的活性。显然凡是可使CK?BB升高的疾病均可影响CK?MB的测定,使其假性增高。
由于免疫抑制法测得CK?MB/CK>50%的患者血清CK总活性均<200 IU/L,而电泳结果显示CK?MB含量并不高,CK?BB含量明显增高,说明这些患者并无心肌损伤,而是存在心外器官损伤。所以在CK总活性不高,而免疫抑制法测得CK?MB明显增高时有必要对CK同工酶进行分析,以判断CK?MB是否假性增高,排除非心肌来源的可能。
鉴于CK及其同工酶在人体中的组织分布差异显著,其相应器官的损伤将直接影响血清CK活性及CK?BB含量的测定,依据CK的总酶活性和CK?BB的电泳百分含量可以大体估计损伤的最大可能性器官,有助于判断肿瘤及自身免疫病等非心源性疾病的受累器官。
由于肿瘤细胞可以出现返祖现象,出现胚胎期的同工酶(CK?BB)使得肿瘤患者血清CK?BB水平明显升高[4]。Hirata等人曾在术前24 h对胃癌手术切除的患者测定CK同工酶,发现几乎所有的患者血清中均有CK?BB[5]。Wang等报道在广泛小细胞肺癌患者血清中测出持续升高的CK?BB同工酶[6]。有研究表明,肺癌患者血清CK?BB活性与病变严重程度呈正相关,尤其远处转移者更明显[7]。Silverman等报道前列腺癌患者血清CK?BB阳性率为75%~89%,且早于组织学和血清ACP的改变[8]。本试验在免疫抑制法测得CK?MB/CK>50%的90份标本中,肿瘤性疾病占68.9%,自身免疫病占13.3%,经CK同工酶电泳进一步分离后均出现CK?BB水平不同程度的升高,同时在30份对照血清中未出现CK?BB含量增高。由于所选标本患者年龄均>6岁排除了胚胎期肝脏合成CK?BB增高的影响,说明肿瘤患者血清中检出CK?BB的概率远大于正常人,差别具有统计学意义(P<0.01),符合肿瘤患者血清CK?BB升高可导致免疫抑制法测定CK?MB活性假性升高的说法。因此当免疫抑制法测得CK?MB/CK>50%,而CK酶活性不高时应进一步用CK同工酶电泳进行分离、鉴定。若电泳示CK?BB条带百分比增高,在排除心源性疾病后,应警惕有恶性肿瘤的可能[9]。此外在本次研究中发现有1例患者初诊是乙肝致肝硬化,其血清CK活性(酶法)及CK?MB活性(免疫抑制法)分别为87 IU/L和57 U/L,而同工酶电泳显示CK?MB含量为7.8%、CK?BB含量高达28.6%,后经检测甲胎蛋白(AFP)及CT确诊为肝癌,所以血清CK?BB的测定可作为肿瘤性疾病的一种辅助诊断指标。
鉴于临床上一些早期肿瘤及自身免疫性疾病的靶器官难以确定,给患者的诊疗带来诸多麻烦,如何通过测定血清中某种特异的酶,来诊断一些特定疾病或特定组织器官的病变显得极为重要。由于人体主要组织器官的CK和CK?BB 的含量存在显著性差异,且CK?BB含量较为丰富的器官损伤时,其血清在CK同工酶电泳中CK?BB百分比明显高于CK?BB含量低的器官损伤,差异具有显著性。本研究发现血清CK的对数值与CK?BB的百分含量存在一定的趋势关系,可能对肿瘤和自身免疫性疾病的器官定位有帮助,对患者的早期诊断和有一定的的应用前景。
【】
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