山楂叶总黄酮防治非酒精性脂肪性肝炎的研究
作者：陈芝芸 严茂祥 何蓓晖
【摘要】 ［目的］观察山楂叶总黄酮(TFHL)抗大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的作用。［方法］采用高脂饲料喂养12周建立大鼠NASH模型，以250、125mg/kg体重/d的TFHL及易善复进行预防和，分别在预防12周及治疗8周后观察肝组织病改变，血清FFA、TG、CHOL、HDL?C、LDL?C、ALT、AST水平及肝组织匀浆TG、CHOL的含量。［结果］模型大鼠肝组织出现了严重脂肪变和不同程度炎症细胞浸润，肝细胞坏死，脂质代谢紊乱，肝脏脂质大量堆积。应用TFHL及易善复进行预防和治疗后，大鼠肝组织脂肪变程度和炎症活动程度较模型大鼠显著降低，肝脏脂质含量较模型大鼠显著降低。［结论］TFHL能调节脂质代谢紊乱，对高脂饮食诱导的NASH有较好的防治作用。
【关键词】 山楂叶总黄酮;脂质代谢;脂肪性肝炎;非酒精性;大鼠
Abstract: ［Objective］ To observe haw leaves total flavone(TFHL) anti rats’ non?alcoholic fat hepatitis（NASH）. ［Method］ Take high?fat forage to feed 12?week rats NASH model, prevent and treat them with 250 and 125 mg/kg/d TFHL, as well as Yishanfu; after 12 weeks and 8 weeks, respectively observe liver tissue pathological changes, the levels of FFA, TG, CHOL, HDL?C, LDL?C, ALT and AST in serum, and the even plasma TG and CHOL contents. ［Result］ In the model rats’ liver tissue, there’ re severe fat change, different degrees of inflammation cells infiltration, liver cytoclasis, disordered lipid metabolism and large accumulation of liver lipid. After prevented and treated with TFHL and Yishanfu, the rats fat change degree of liver tissue and inflammation movement were much more decreased than model rats, so was liver lipid content. ［Conclusion］ TFHL can regulate lipid metabolism disorder, has good prevention and treatment to NASH caused by high?fat forage.
Key words： TFHL; lipid metabolism; fat hepatitis; non?alcoholic; rats
山楂叶总黄酮（total flavones of hawthorn leafon, TFHL)为蔷薇科山楂属植物山里红CrataegusPinnatifidaBge.VarMajorN.E.BR.或山楂Crataegus Pinnatifida Bge.的干燥叶提取的总黄酮。主要成份有牡荆素鼠李糖甙、金丝桃苷和低前聚氰定等。药理研究发现其具有降压、增加冠脉流量、强心、抗心率不齐、降血脂、抗氧化应激等作用［1?4］。本研究通过高脂饮食建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（nonalcohdic steatohepatitis，NASH）模型，进一步探讨山楂叶总黄酮对NASH的的防治作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠100只，雄性，清洁级，体重190～210g，由上海西普尔-必凯实验动物中心提供。
1.2 主要药品与试剂
山楂叶总黄酮由山西晋城中晋药业有限公司提供，其中总黄酮含量为96.50％，易善复由（德国）A. Nattermann & Cie. GmebH生产，胆固醇由上海博奥生物科技有限公司提供，3号胆盐由杭州微生物试剂有限公司，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL?C）等试剂盒均由上海申能-德赛诊断技术有限公司提供，血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL?C）试剂盒由上海复星长征医学有限公司提供，血清游离脂肪酸（FFA）试剂盒由日本第一化学试剂株式会社提供。
1.3 NASH模型的建立
大鼠每天以高脂饲料（82%普通标准饲料＋10％猪油＋2%胆固醇＋1%胆盐＋5%蛋黄粉）喂养，连续12周建立NASH模型大鼠。
1.4 山楂叶总黄酮预防作用的研究
50只鼠随机分为正常Ⅰ组、模型Ⅰ组、易善复预防组、山楂叶总黄酮预防高剂量组（简称TFHL预防高剂量组）、山楂叶总黄酮预防低剂量组（简称TFHL预防低剂量组），每组10只，除正常组喂以标准饲料外，其余4组均喂以高脂饲料，连续12周；在造模同时，易善复组予195.40mg/kg体重/d易善复混悬液灌胃，TFHL预防高、低剂量组分别予TFHL250mg/kg体重/d、125mg/kg体重/d灌胃，正常Ⅰ组及模型Ⅰ组大鼠均灌服等量蒸馏水，用药12周,自由进食和饮水。
1.5 山楂叶总黄酮治疗作用的研究
50只大鼠随机分为正常组10只，每天予标准饲料喂养，造模组40只，每天予高脂饲料喂养，连续12周；造模结束后将造模组随机分为模型Ⅱ组、易善复治疗组、山楂叶总黄酮治疗高剂量组（简称TFHL治疗高剂量组）、山楂叶总黄酮治疗低剂量组（简称TFHL治疗低剂量组），每组10只，正常组10只则设为正常Ⅱ组。各药物治疗组用药剂量与预防用药相同，共治疗8周，治疗期间易善复治疗组和TFHL治疗低剂量组各1只大鼠因灌胃不当药物吸入气管而死亡。
预防和治疗各组大鼠在末次给药次日上午空腹取血分离血清待用。取肝组织，部分以生理盐水制成匀浆，部分肝右叶以4％多聚甲醛固定后制备石蜡切片。
1.6 检测指标
血清ALT、AST、TG、CHOL、HDL?C、LDL?C、FFA采用全自动生化仪检测；肝组织匀浆TG采用异丙醇提取、氧化铝吸附磷脂和乙酰丙酮显色法测定，CHOL采用异丙醇提取，高铁、硫酸显色法测定。肝组织病理学检查：常规HE染色，光镜下观察肝脏细胞脂肪变性及炎症浸润程度，非酒精性脂肪性肝病的病理组织学诊断2006年2月中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的“非酒精性脂肪性肝病诊疗指南”［5］，其中脂肪变程度分4度（F1?F4）；炎症程度分为3级：G0(-)、G1(+)、G2(2+)、G3(3+)。
1.7 统计学方法
采用SPSS12.0 for windows软件包统计，计量资料采用单因素方差分析和t检验，计数资料采用非参数的秩和检验。
2 结果
2.1 各组大鼠肝组织病改变
正常Ⅰ组、正常Ⅱ组大鼠肝组织光镜下未见明显异常；模型Ⅰ组大鼠肝组织可见弥漫性肝细胞脂肪变(F4)，伴明显肝细胞气球样变，小叶内和汇管区混合性炎细响浸润，以小叶内明显，部分坏死灶融合成片，未见明显肝纤维化形成；各药物预防组大鼠肝组织也见弥漫性肝细胞脂肪变(F4)，肝组织的炎症分布和性质与模型Ⅰ组相似，但各药物预防组的炎症程度较模型1组显著下降（P<0.05），见表1。模型Ⅱ组大鼠肝组织仍可见中到重度弥漫性肝细胞脂肪变(F2?F4)，伴小叶内炎症及汇管区有炎细胞浸润，以小叶内炎症明显，个别有碎屑样坏死，但程度较模型1组轻；各药物组大鼠肝组织脂肪变以中度为主(F2?F3)，肝组织的炎症程度较模型Ⅱ组显著降低（P<0.05），见表2。表1 预防用药各组大鼠肝组织炎症程度的变化（略）表2 治疗用药各组大鼠肝组织炎症程度的变化（略）
2.2 TFHL对NASH大鼠血清ALT、AST的影响
模型Ⅰ组大鼠血清ALT、AST水平较正常Ⅰ组明显增高（P<0.01），TFHL预防高、低剂量组及易善复预防组大鼠血清ALT、AST水平较模型Ⅰ组明显降低(P<0.01，P<0.05)；三个药物干预组之间差异无显著性(P>0.05)，见表3。模型Ⅱ组大鼠血清ALT水平较正常Ⅱ组明显增高(P>0.05)，TFHL治疗高、低剂量组及易善复治疗组ALT水平则较模型Ⅱ组明显降低；大鼠血清AST水平在治疗用药各组之间差异无显著性(P>0.05)，见表4。表3 预防用药各组大鼠血清ALT、ASTL的变化（略）表4 治疗用药各组大鼠血清ALT、AST的变化（略）
2.3 TFHL对NASH大鼠血脂的影响：模型Ⅰ组、易善复预防组、TFHL预防高、低剂量组大鼠血清CHOL、LDL?C含量较正常Ⅰ组明显升高（P<0.01）；模型Ⅰ组TG含量较正常Ⅰ组明显减少（P<0.05）；模型Ⅰ组、易善复预防组HDL?C含量较正常Ⅰ组明显降低（P<0.01，P<0.05），FFA含量则较正常Ⅰ组明显增高（P<0.01，P<0.05）；见表5。模型Ⅱ组大鼠血清FFA含量较正常Ⅱ组显著增高（P<0.01），易善复治疗组、TFHL治疗高、低剂量组FFA含量较模型Ⅱ组明显降低（P<0.05）；模型Ⅱ组、易善复治疗组、TFHL治疗高、低剂量组大鼠血清CHOL、LDL?C均较正常Ⅱ组显著升高（P<0.05）；血清TG、HDL?C含量在治疗用药各组之间差异无显著性(P>0.05)，见表6。表5 预防用药各组大鼠血脂的变化（略）表6 治疗用药各组大鼠血脂的比较（略）
2.4 TFHL对NASH大鼠肝组织匀浆TG、CHOL的影响
模型Ⅰ组、易善复预防组、TFHL预防高、低剂量组大鼠肝匀浆TG、CHOL含量较正常Ⅰ组明显增高（P<0.01），TFHL预防高、低剂量组大鼠肝匀浆CHOL含量较模型Ⅰ组、易善复预防组明显下降（P<0.01），见表7。模型Ⅱ组、易善复治疗组、TFHL治疗高、低剂量组大鼠肝匀浆TG、CHOL含量均较正常Ⅱ组显著增高（P<0.01），易善复治疗组、TFHL治疗高、低剂量组肝匀浆TG、CHOL含量较模型Ⅱ组明显降低（P<0.05），见表8。表7 预防用药各组大鼠肝匀浆TG、CHOL的影响（略）表8 治疗用药各组大鼠肝匀浆TG、CHOL的影响（略）
3 讨论
目前认为单纯性脂肪肝进展缓慢而预后相对良好，但非酒精性脂肪性肝炎(non?alcoholic steatohepatitis，NASH)有肝脏炎症的生化和组织学改变，25％NASH患者可为肝纤维化，并且约有1.5～8.0％ 的患者可进展为肝硬化，甚至肝癌。因此如何有效地阻断这一病变的发生、发展，具有十分重要的临床意义。由于NASH的病因和发病机制复杂，许多问题尚在研究之中，目前可供用于治疗脂肪性肝病的药物极其有限，迄今为止尚未找到治疗NASH的特效药物。
与正常Ⅱ组比,*P<0.01，△△P<0.05；与模型Ⅱ组比,△△P<0.05
肝脏是脂类合成和分解代谢的中心器官。肝脏内的脂肪主要来源于食物，食物中的脂肪进入人体后，在小肠被胆汁和胰酶水解成FFA和甘油，它们被小肠粘膜上皮细胞吸收后重新酯化成TG，再与胆固醇、磷脂及肠粘膜上皮细胞合成的载脂蛋白结合形成乳糜颗粒，由淋巴管进入血液，在肝外全身血管中运送时，被存在于毛细血管壁的脂蛋白酯酶水解为脂肪酸和甘油，除被组织摄取、利用外，脂肪酸可进入肝脏参与代谢，或经血管壁进入脂肪组织以TG形式储存起来。乳糜颗粒进入肝内毛细血管时可被肝脏巨噬细胞分解为甘油和脂肪酸。高脂饮食时，输入肝脏的脂质及脂肪酸过多而肝脏脂蛋白(主要是VLDL)合成代谢发生障碍，脂肪酸氧化又不足，脂肪就会在肝脏沉积，发生脂肪肝。本研究发现，采用高脂饮食喂养大鼠12周后,大鼠血清CHOL、LDL?C、FFA、ALT、AST明显升高，而TG、HDL?C水平则较正常大鼠明显降低，肝组织匀浆TG、CHOL含量较正常大鼠显著升高；组织学观察发现肝脏脂肪变的复制率达100%，同时伴炎症、坏死，表明长期摄入高脂饮食其体内的脂类合成增加,导致肝脏脂质代谢发生障碍,肝内脂质类物质合成与分泌的动态平衡失调,当肝内TG蓄积到一定程度,即发生肝脏组织学改变,形成脂肪肝,在病因（高脂饮食）持续存在时，单纯性脂肪肝进展为脂肪性肝炎。这与人类非酒精性脂肪性肝病发病过程相符合。
山楂是蔷薇科山楂属植物，为药食同源植物，性味酸、甘、微温，归脾、胃、肝经；主要功能为消食健胃、行气散瘀，用于肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、心腹刺痛等。与山楂果实相比较，山楂叶具有资源广泛、收获量大、有效成分含量高等特点。TFHL是从山楂叶中提取的黄酮类化合物的总称，含牡荆素鼠李糖甙、金丝桃苷和低前聚氰定等三十余种单体，具有降压、强心、抑制或清除氧自由基、抗脂质过氧化、调节血脂、改善肝微循环及抗炎症损伤等作用。本研究发现，采用TFHL和易善复预防干预12周后，NASH大鼠肝组织炎症程度明显减轻，血清ALT、AST水平明显下降，同时TFHL预防高、低剂量组肝匀浆CHOL含量明显下降；采用TFHL及易善复治疗8周后，NASH大鼠肝组织脂肪变和炎症程度均显著减轻，血清ALT、AST、FFA及肝匀浆TG、CHOL水平均显著下降，提示TFHL和易善复能调节脂质代谢紊乱，对高脂饮食诱导的NASH有较好的防治作用。TFHL防治NASH具体的作用机制将另文探讨。
本研究发现，在喂养高脂饮食同时应用TFHL，造模大鼠肝组织的炎症程度有明显改善，但大鼠肝组织的脂肪变程度仍无显著改善，肝组织TG含量也无明显下降；对大鼠控制饮食（由高脂饲料改为标准饲料）同时以TFHL治疗后，大鼠肝组织脂肪变性程度则明显改善，肝匀浆TG含量也明显减少，表明在NASH的防治中,去除高脂饮食这一致病因素仍是其最基本和关键的措施。实验中观察到模型Ⅰ组大鼠血清TG含量较正常Ⅰ组大鼠明显下降，而肝组织匀浆TG水平则较正常Ⅰ组大鼠显著增高；而模型Ⅱ组大鼠以高脂饮食造模12周后改用标准饲料喂养8周,大鼠肝组织脂肪变和炎症程度明显好转的同时，血清TG的含量也与正常Ⅱ组相接近，因此我们认为血清TG在模型Ⅰ组中的变化可能与长期的高脂饲料造成肝细胞严重的脂肪变和肝组织的炎症，肝脏转运TG入血液的能力大大减弱有关。
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