TGF-β/Smads信号转导通路与肾间质纤维化的关系

【摘要】  Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受体的胞内激酶底物，介导了TGF-β的胞内信号转导。TGF-β参与肾纤维化的各个环节，如增加细胞外基质（ECM）的合成、抑制ECM的降解；增强细胞表面的受体-整合素的表达，使细胞与基质黏附增强，促使ECM沉积；TGF-β的自我诱生作用，即在损伤部位释放TGF-β可诱导细胞产生更多的TGF-β，从而在局部放大了其生物学作用。TGF-β介导的肾纤维化可为Smad2、Smad3激活，而为Smad7所阻断，通过提高Smad7的表达以阻断TGF-β信号转导途径可能为肾纤维化的一种手段。通过对Smads介导的TGF-β胞内信号转导的深入研究，可以有助于对肾脏纤维化发病机制的理解，从而探索新的治疗途径和开发临床新药物。

【关键词】  转化生长因子；肾间质纤维化；信号转导通路；TGF-β；Smads蛋白

   转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一种多功能的细胞因子。按照结构和生物学功能的不同，TGF-β超家族成员主要分为米勒抑制物家族（mullerian inhibitory substance，MIS）、抑制素/活化素（inhibit/activin）家族、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）家族和TGF-β家族。它们在调节许多基本的生物学过程，如细胞的增殖、分化，胚胎发育、器官形成、组织的修复和凋亡中起着重要的作用［1］。Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受体的胞内激酶底物，介导了TGF-β的胞内信号转导。已有的研究证实，TGF-β及其细胞内信号蛋白Smads的激活在多种器官和组织（如肾、肝、肺、心等）的纤维化过程中发挥着重要作用。

    1   TGF-β结构

    TGF-β有5种异构体，其中TGF-β1~3型存在于哺乳动物中，以TGF-β1的含量最为丰富。TGF-β1最初为潜在的无活性复合物的形式，包括三种：①小分子无活性复合物，由成熟TGF-β1与TGF-β1前体的N端，即无活性结合肽（latent associated peptide，LAP）通过非共价键连接而成，相对分子质量105 000；②大分子无活性复合物，由小分子无活性复合物与无活性TGF-β1结合蛋白通过二硫键连接而成，相对分子质量235 000；③α2巨球蛋白- TGF-β1复合物，由成熟TGF-β1与血浆中α2巨球蛋白结合而成，为TGF-β1在血浆中的存在形式。在体外TGF-β1的无活性复合物可被酸、碱、尿素或加热等处理而活化。在体内的活化过程可能与细胞来源的纤溶酶或组织蛋白酶降解LAP，从而释放出活性TGF-β1有关。成熟的TGF-β1分子量为25 KD，为由两个分子量为12.5 KD的亚基通过两个二硫键连接而成的同源二聚体。只有二聚体形式的TGF-β1才具有生物活性，几乎存在于所有的组织细胞中。TGF-β的氨基酸序列相当保守，人和鼠的氨基酸序列中仅有一个氨基酸不同，其同源性高达99%。机体大部分细胞都能合成TGF-β，如肿瘤细胞、抗原激活的T细胞、脂多糖激活的单核细胞、B细胞、血小板以及分化活跃的组织细胞等。促使肾组织中TGF-β活化的因素包括AngⅡ、高糖、血栓素A2、低密度脂蛋白及氧化压力等。

    2   TGF-β受体

    几乎所有的人体正常组织细胞表面都有TGF-β受体。目前人体内已经发现的TGF-β受体有Ⅰ~Ⅴ5种类型。Ⅰ型（53~65 kD）、Ⅱ型（85~100 kD）均为糖蛋白，为信号传递受体，其受体的胞质区段有丝氨酸/苏氨酸激酶，他们与TGF-β1的亲和力是TGF-β3的10倍。Ⅲ型受体（250~300 kD）为蛋白多糖，含有类肝素、硫酸葡糖胺聚糖链。Ⅲ型受体分为膜结合型和游离型，前者无信号传递活性，但能增强TGF-β与Ⅱ型受体的亲和力；后者能结合并阻止TGF-β与靶位点结合，从而干扰TGF-β的生物学活性。Ⅳ、Ⅴ型受体作用尚不清楚。TGF-β与受体结合后的第2信使通路可能为与Smads蛋白磷酸化所形成的二聚体再进入细胞核与DNA结合蛋白结合，调节靶蛋白的表达，从而发挥其生物学效应。

    3   Smads分子的结构和功能

    Smads蛋白为TGF-β受体下游的信号转导因子，在整个发育过程和几乎所有的成熟组织中，Smads均有广泛表达［2］。目前发现哺乳动物Smads有8种（Smad1~Smad8）。典型的Smads蛋白由3部分组成，氨基端、羧基端高度保守的MH1和MH2结构域及其间富含脯氨酸的间隔区。其中Smad2~Smad4，Smad7参与TGF-β的信号转导，其他Smads蛋白参与骨形态发生蛋白和活化素等的信号转导［3］。按其生理功能Smads蛋白可分为3类。其中①受体激活的Smads（receptor activated Smads，R-Smads），包括Smad1、2、3、5、8及果蝇的Mad（mother against dpp）。R-Smad分子C末端有保守的SSXS基序（X是疏水性氨基酸残基），之中的丝氨酸残基是受体PSTK的磷酸化部位。R-Smad被磷酸化后与Smad4结合成二聚体转入核内。②共同介体性Smads（common mediater Smads，Co-Smads），包括Smad4和果蝇的Medea。它不是受体的直接底物，因此它的C末端无保守的SSXS基它。但它能通过与R-Smad形成二聚体，参与TGF-β的信号转导，并为对靶基固的转录调节作用所必需。③抗Smads（inhibitory Smads，Ⅰ-Smads），包括Smad6、Smad7和果蝇的Dad（daughter against dpp），Smad6、7可与活化的TGF-β受体牢固结合，阻止R-Smads的磷酸化，从而对超家族信号传递起负调控作用；Smad6还可抑制Smad4与R-Smads的结合，从而抑制信号传导。TGF-β等刺激受体细胞后，抑制性Smads的mRNA转录被诱导，故在TGF-β信号转导中抑制性Smads为一种自身调节的负反馈信号［4］。有研究发现Smad6和Smad7均是细胞内Ⅰ型受体丝氨酸/苏氨酸激酶的拮抗蛋白，结构上C端没有SSXS基序，所以不能被受体磷酸化，但可与活化TGF-β、BMP-Ⅰ型受体牢固结合，阻止R-Smads的磷酸化，从而对超家族信号传递起负调控作用［5］。

    4   TGF-β/Smads信号转导通路

    与配体结合后，TGF-β家族受体激活了一个由Smads蛋白家族介导的独特的信号转导通路。基本的TGF-β/Smads信号转导途径为：TGF-β超家族成员先与细胞膜上的TGF-βⅡ型受体结合，然后吸收Ⅰ型受体在细胞膜上形成一个异源复合物，Ⅰ型受体被Ⅱ型受体激酶磷酸化并被激活，活化的Ⅰ型受体与Smads暂时结合，磷酸化R-Smads C端Ser残基。Smad1、5、8被BMP受体磷酸化，介导BMP信号；Smad2、3被activin和TGF-β受体所活化，介导这些因子的效应。受体对R-Smads的磷酸化使活化的Smads构象发生变化从受体上解离下来，并与Co-Smad（Smad 4）结合形成复合物转入核内，激活的复合物和两类DNA结合辅助因子即共抑制子、共激活子结合决定靶基因的转录活性［6］。在广泛的机体紊乱，包括自身免疫性疾病、恶性肿瘤和慢性肾病中已观察到TGF-β信号转导通路的异常［7］。

    5   TGF-β1的生物学作用

    5.1   对细胞增殖的作用

    TGF-β1对细胞的分裂有促进和抑制双重作用，能抑制大多数细胞的增殖，包括肾小管上皮细胞、肾小球上皮细胞和内皮细胞；能刺激成骨细胞的增殖；对某些细胞如肾小球系膜细胞、成纤维细胞，具有双重作用，低浓度时刺激增殖，高浓度时抑制增殖。

    5.2   对细胞外基质（ECM）的影响

    TGF-β1主要通过4个方面强烈刺激ECM的合成和沉积，①增加ECM蛋白的合成；②减少ECM的降解；③增强细胞表面的ECM受体—整合素的表达，使细胞与基质黏附增强，促使ECM沉积；④TGF-β1自我诱生作用，即在损伤部位释放TGF-β1可诱导细胞产生更多的TGF-β1，从而在局部放大了其生物学作用。

    5.3   对免疫调节的作用

    研究表明TGF-β1能抑制T、B淋巴细胞的增生和活化，从而使活化的B淋巴细胞分泌免疫球蛋白减少，但能促进IgA分泌；能刺激和/或抑制多种细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）、血小板源生长因子（PDGF）等而调节免疫。

    6   TGF-β1与肾间质纤维化的关系

    虽然多种细胞因子如白介素-α及β、血小板源生长因子、TGF-α、TGF-β和肿瘤坏死因子α具有致肾纤维化的作用，但TGF-β是最主要的，且参与肾间质纤维化的各个环节。活化TGF-β可产生许多与肾纤维化有关的反应，包括基质合成增多、抑制基质降解、整合素基质黏附分子的上调，以及成纤维细胞和单核细胞的趋化。单侧输尿管梗阻（UUO）模型是一个较好的肾小管间质纤维化模型，即使梗阻原因解除后，仍然存在进行性肾小管间质基质沉积。目前认为该模型基质沉积与一些细胞因子的高表达有关［8］。其中许多学者认为TGF-β的作用是主要的［9~10］。Li JH［11］等观察到在正常大鼠肾小管上皮细胞系（NRK52E）中，TGF-β1可剂量和时间依赖性地诱导Smad2磷酸化，上调Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原的表达，使肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TEC）向肌成纤维细胞（myofibro-blasts，MFB）表型转化。Lan H Y等［12］发现，与正常大鼠相比，UUO模型大鼠肾脏中Smad2和Smad3活性升高6倍，并伴随明显的肾小管间质的纤维化，Smad7的表达则显著降低。应用超声介导系统转染Smad7基因至模型大鼠肾脏，可将Smad7基因表达提高5倍，同时Smda2和Smad3活性明显受抑，肌成纤维细胞积聚下降85%，肾小管间质纤维化程度明显减轻，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达水平显著降低。提示TGF-β介导的肾纤维化可为Smad2、3激活，而为Smad7所阻断。通过提高Smad7表达以阻断TGF-β信号转导途径可能为肾纤维化的一种手段。

    7   TGF-β1与慢性肾脏疾病肾纤维化的关系

    肾小球硬化和肾间质纤维化是各种原因所致肾脏进行性损害直至肾功能衰竭的最后共同通路。在众多促纤维化的因子中，TGF-β1被认为是最重要的促纤维化因子之一，它在肾小球硬化和肾间质纤维化中扮演着极为重要的角色。TGF-β1的重要生物学作用为增加ECM的合成、抑制ECM的降解，而ECM在肾小球的异常沉积是引起肾小球硬化的主要原因之一。Isaka等［13］利用基因转染技术，利用脂质体将TGF-β1、cDNA经肾动脉转导入正常鼠肾小球内，在正常的肾小球内即出现TGF-β1的过度表达，导致ECM沉积，1 w内肾小球就发生硬化，这是支持TGF-β1致肾硬化的最直接证据；Yamamoto成功建立模仿人类肾小球肾炎的大鼠模型，向大鼠一次性注射抗胸腺细胞血清（anti-thymocyte serum，ATS）诱导了急性系膜增生性肾炎，4 d后发现肾小球内TGF-β1 mRNA及蛋白表达明显升高，伴随ECM成分增加，4 w后回复至基础水平；重复注射ATS建立的慢性系膜增生性肾小球肾炎动物模型中，TGF-β1在肾小球、肾小管间质中持续表达，ECM沉积，18 w后导致肾小球严重硬化，小管间质纤维化，肾功能衰竭；Yamamoto等［14］通过对53例肾活检病人的分析，发现正常肾脏组织中只有少数肾小球细胞表达少量的TGF-β1 mRNA，而在人类肾小球疾病中，肾内TGF-β1 mRNA含量明显升高，且与肾间质纤维化密切相关。

    8   结   语

    综上所述，TGF-β家族是复杂的，而且又是多功能的，它是组织损伤、修复的必要成分，同时它又促使ECM沉积，使病变肾脏朝向肾纤维化。通过对Smads介导的TGF-β胞内信号转导的深入研究，可以有助于对肾脏纤维化发病机制的理解，从而探索新的治疗途径和开发临床新药物。

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