补肾通络中药对类风湿性关节炎Foxp3表达的影响
【摘要】 目的:观察补肾通络中药对类风湿性关节炎患者Foxp3表达的影响。方法:随机选择来我院健康体检者30例为对照组,同时选择我院门诊类风湿性关节炎患者50例为组。治疗组患者(初治/或经过两周的清除期)内服补肾通络方3个月后,提取所有受试者外周血总RNA,逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR法检测对照组和治疗组治疗前后Foxp3 mRNA的含量。结果:治疗组治疗前后外周血Foxp3表达水平均明显低于对照组(P<0.01),治疗组治疗后外周血Foxp3表达水平亦明显高于治疗前(P<0.01)。结论:类风湿性关节炎患者存在表达Foxp3的调节性T细胞数量减少和/或功能降低,这种调节性T细胞亚群的异常可能参与了类风湿性关节炎的发病和病变进展,补肾通络中药治疗类风湿性关节炎可能是通过上调Foxp3表达而发挥作用。
【关键词】 类风湿性关节炎 补肾通络中药 Foxp3 mRNA 实时荧光定量PCR法 β2m 调节免疫功能
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节炎为主要特征的系统性自身免疫疾病。RA源于免疫平衡失调,机体通过多种机制调控自身免疫应答,其机制十分复杂,调节性T细胞在免疫平衡机制方面起着重要作用,但其在RA发病机制中的作用尚不清楚。本研究对中药治疗RA后外周血调节性T细胞的特异性标志Foxp3进行测定,探讨Foxp3在RA发病中的意义,探讨中药调控T细胞介导RA适应性免疫应答的机制,为RA发病机制及用补肾通络中药防治RA提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
随机选取来我院体检的30例健康者作为正常对照组(对照组),同时选择我院门诊50例RA患者作为治疗组。对照组中男12例,女18例;年龄最小15岁,最大57岁,平均(52.19±10.50)岁;治疗组中男18例,女32例;年龄最小13岁,最大61岁,平均(51.21±11.73)岁;病程最短3年,最长15年,平均(7.5±2.6)年。所有RA病例均符合美国风湿病学会1987年的类风湿性关节炎分类诊断标准[1]。
1.2 治疗方法
治疗组(初治/或经过2 w的清除期)内服补肾通络方,药物组成:制附子先煎12 g ,制川乌先煎12 g,淫羊藿12 g,补骨脂15 g,桑寄生30 g,丹参10 g,熟地黄15 g,独活15 g,木瓜30 g,威灵仙15 g,雷公藤10 g,全蝎研末冲服3 g,乌梢蛇10 g,甘草6 g。临床随证加减:气血虚者加黄芪30 g, 当归15 g;痛甚者加细辛3 g,制草乌先煎9 g;肿胀明显者加萆薢9 g,生苡仁15 g;关节僵直者选加乳香、没药各6 g;局部有风湿结节者加赤芍10 g,白芥子12 g。小儿酌情减量。每日1剂,早晚分服。1个月为1个疗程,共治疗3个月。
1.3 实验方法
1.3.1 RNA提取和逆转录反应 受试者禁食12 h以上,清晨空腹采取静脉血10 mL。采用淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品有限公司生产)分离外周血单个核细胞,利用Trizol (美国Invitrogen公司生产)一步法提取外周血单个核细胞总RNA,取总RNA2 μg进行逆转录反应合成cDNA,-80 ℃保存。
1.3.2 Foxp3定量标准品的构建 取上述cDNA2 μL,进行PCR 扩增。Foxp3 引物(上海博亚公司合成): 5′-TCAAGCACTGCCAGGCG-3′和5′-CAGGAGCCCTTGTCGTCGGAT-3′。将PCR产物插入pgM-T载体(北京天为时代公司生产),并转化感受态大肠杆菌TOP10 (北京天为时代公司生产) ,经蓝白斑筛选获得阳性克隆,测序鉴定目的片段插入正确。抽提质粒,并进行1∶10倍比稀释,制成107 ng/mL、106 ng/mL、105 ng/mL、104 ng/mL和103 ng/mL共5个标准品,分装后-20 ℃保存。
1.3.3 外参照β2m定量标准品的构建 取上述cDNA2 μL,进行PCR扩增。β2m引物(上海博亚公司合成):5′-CCAGCAGCGAATGGAAACTC-3′和5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3′。余步骤同1.3.2。
1.3.4 荧光定量PCR法检测Foxp3 mRNA相对含量 取上述cDNA1 μL,使用Quant SYBR green PCR kit(美国ABI公司生产)进行PCR扩增,终体积25 μL。同时进行各自标准品的扩增,每个样本均重复3 复孔。PCR反应条件: 50 ℃ 2 min, 95 ℃ 10 min,扩增40个循环(95 ℃ 30秒, 52 ℃ 30秒,72 ℃ 30秒) 。为了消除样本提取、逆转录和PCR反应过程中造成的差异,以Foxp3 mRNA 和β2m mRNA 含量的比值,即Foxp3的相对表达水平,作为评价Foxp3表达水平的指标。
1.4 统计学方法
结果采用SPSS 10.0 进行统计分析,各组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 疗效标准
参照国家中医药管理局1994 年发布的《中医病证诊断标准》类风湿性关节炎的疗效评定标准[2]。痊愈: 关节疼痛肿胀消失、晨僵消除;好转: 关节疼痛肿胀消失, 偶有痛感,晨起稍有僵硬;无效: 关节疼痛肿胀、晨僵同前。
2.2 疗效观察
2.1.1 补肾通络中药治疗RA的疗效 50例RA患者中,痊愈28例,好转15例,无效7例,有效率86.00%。
2.2.2 补肾通络中药对外周血Foxp3基因表达水平的影响 治疗组治疗前Foxp3基因表达水平为(2.11±1.05),治疗后为(4.39±1.78),治疗前后比较有显著性差异(P<0.01);对照组Foxp3基因表达水平为(12.62±5.37),与治疗组比较有显著性差异(P<0.01)。
3 讨 论
类风湿性关节炎的发病是由多种因素共同作用的结果,自身免疫反应是其中的重要环节,其中Tr细胞(即调节性T细胞)在免疫平衡机制方面起着重要作用。因此,立足调节T细胞探讨其介导类风湿性关节炎的作用机制具有重要意义。新近一项研究证实Foxp3可以调节Tr细胞的发育和功能,为免疫调节的初始开关,在免疫调节中起关键作用[3~4]。另有研究表明Foxp3在自身免疫性疾病中低表达,通过Foxp3转基因动物实验证实,增强Foxp3基因表达可预防和减少这类自身免疫性疾病的发生。定量检测Foxp3基因表达水平,可评估机体免疫平衡状况。本研究结果提示 RA患者外周血Foxp3表达水平显著低于健康对照组,表明RA患者体内可能存在表达Foxp3的调节性T细胞减少和/或功能降低。
类风湿性关节炎属于中医“痹病”范畴,祖国医学认为本病由于先天禀赋不足、正气亏虚,感受风寒湿热之邪,致使气血运行受阻,痰凝血瘀,痹阻于肌肉、骨节、经络之间,引起关节疼痛、肿胀、晨僵,甚至关节变形,活动受限,重则丧失劳动能力。故宜益气养血、补肾壮骨以扶正,祛风、散寒、除湿、清热以祛邪,兼以通络。我们认为肾虚是其发病的关键环节,免疫紊乱是RA发生的根本原因。根据上述理论,我们在痹证研究中,克服单因素致痹研究的缺陷,从肾虚入手,提出治疗RA的主要原则是补肾通络,据此治疗原则筛选中药组成防治RA的补肾通络方。该方以补骨脂补肾助阳壮骨为君药;辅以淫羊藿、桑寄生补肾壮骨,熟地黄滋阴养血、补益肝肾,雷公藤祛风除湿、活血通络,制附子、制川乌祛风除湿、温经通络为臣药;配以丹参活血通络,独活、木瓜、乌梢蛇、全蝎、威灵仙祛湿通络,共为佐药;再以甘草调中和胃为使药。诸药合用共奏补肾通络,活血祛湿之功。经过一系列的实验与临床研究表明,该方能补肾壮骨,增强自身免疫系统,增强抗病能力,而且能祛湿除痹,通经活络止痛,且无毒副作用,是一个较理想的防治RA的中药制剂。同时RA患者通过补肾通络中药治疗后外周血Foxp3表达水平增高,表明补肾通络中药可能通过调节机体免疫功能改善RA患者外周血调节性T细胞的水平而发挥治疗作用,其具体机制尚待进一步研究。
【】
[1]Amett F C,Edworth S,Bllk D A,et al. The 1987 revised ARA criteriafor rheumatoid arthritis[J]. Arthritis & Rheum,1987(30):17.
[2]国家中医药管理局. 中医病证诊断疗效标准[M]. 南京:南京大学出版社,1994:29.
[3]Wei W Z,Morris G P,Kong Y C. Anti-tumor immunity and auto- immunity:A balancing act of regulatory T cells[J]. Cancer Immunol Immunother,2004,53(2):73-78.
[4]Hori S,Nomura T,Sakaguchi S. Control of Regulatory T cell Develo-pment by the Transcription Factor Foxp3[J]. Science,2003,299(5 609):1 057-1 061.