秦艽水煎液对家兔全脑缺血再灌注损伤模型HSP70表达的影响

               作者：刘建红 李福安 李建华

【摘要】  目的 观察秦艽水煎液(Gentiana water exact)对家兔全脑缺血再灌注损伤模型热休克蛋白70(HSP70)表达的影响，探讨Gentiana water exact 对全脑缺血再灌注损伤的保护机制。 方法 参照Pulsinelli等造模方法进行改良，结扎双侧椎动脉，夹闭双侧颈总动脉，制成“四管闭塞法”全脑缺血模型。缺血5 min后分别于再灌注12 h、24 h、48 h取材，使用免疫组化技术检测家兔全脑缺血再灌注损伤模型双侧海马CA1区HSP70的表达。 结果 Sham组无表达；I/R组与G组阳性表达，且随灌注时间的延长而表达增强，24 h达到高峰；与I/R组相比，G组各时间点的HSP70表达明显增多（P＜0.05）。 结论 秦艽可以通过对HSP70表达的上调，达到对脑损伤的保护作用。 刘建红（1972～ ），女，汉族，河北籍，主治医师，青海大学医学院2005级研究生

【关键词】  秦艽水煎液 脑缺血 再灌注 热休克蛋白70

    Abstract  Objective  To investigate the effects of Gentiana water extract on the heat shock protein 70 expression in global cerebral ischemia-reperfusion injury in rabbits.  Methods  According to the Pulsinelli model building method，we legate bilateral vertebral artery and clamp bilateral CCA, use four-vessel occlusion method to make the complete cerebral ischemia-reperfusion model. After global cerebral ischemia established for 5 minutes, we bring out the organization of different group at reperfusion 12h, 24h, 48h respectively and use immunohistochemistry to detect the HSP70 expression in bilateral hippocampus CA1 section.  Results There is  no expression of HSP70 in the Sham group; the expression in the G is significantly higher compared with the I/R at above point（P＜0.05）; there is a increasing trend on HSP70 expression with reperfusion time extension, the expression reached summit at ischemia-reperfusion 24h, then begins to decrease. Conclusion Gentiana water extract can evidently increase HSP70 expression in global cerebral ischemia-reperfusion injury in rabbits as a consequence to protect nerve cells in cerebral ischemia-reperfusion injury.

    Key words  Gentiana water extract  Cerebral ischemia  Ischemia-reperfusion   Heat shock protein70

    秦艽（Gentiana），始见于《神农本草经》，具有祛风湿、止痹痛、退虚热、清湿热等功效，被历代医家广泛用于风湿痹痛、筋脉拘挛、手足不遂、骨蒸潮热及中风、湿热、黄疸等症。热休克蛋白（heat shock protein,HSP）70,是一类在进化上高度保守，广泛存在于原核生物和真核生物中，在高温、缺血、缺氧、损伤等应激刺激下诱导产生的蛋白质，具有神经保护作用［1］。秦艽在治疗中风中有较好的疗效，但是否影响神经细胞HSP70表达，未见报道，本研究通过观察秦艽水煎液对家兔全脑缺血再灌注损伤模型HSP70表达的影响，来为秦艽临床治疗脑缺血提供新的理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组

    35只青紫兰家兔，雌雄不限，体重（2±0.2 ）Kg，由青海医学院实验动物中心提供。随机分为3组，假手术组(Sham组)、缺血再灌注组（I/R组）和秦艽水煎液治疗组(G组)，I/R组和G组根据不同时间点又分为脑缺血5 min再灌注12 h、24 h、48 h组，每组均为5只。 各组均于实验前7 d开始灌胃给药，G组给予0.5 g/ml秦艽水煎液，1.65 g/Kg，1次/d，连续7 d；Sham组和I/R组给予等量的生理盐水。

    1.2  动物模型制备

    对Pulsinelli［2］造模方法进行改良，建立家兔全脑缺血模型：3%戊巴比妥钠（1ml/kg）行耳缘静脉注射麻醉，分离双侧颈总动脉和椎动脉，结扎双侧椎动脉，然后以动脉夹夹闭双侧颈总动脉，制成“四管闭塞法”全脑缺血模型。在全脑缺血5 min后，重新开放双侧颈总动脉夹，制成脑缺血再灌注模型，分别于12 h、24 h、48 h时取材；Sham组只暴露双侧颈总及椎动脉，不阻断血流，24 h后取材。

    1.3  组织处理及免疫组化检测

    1.3.1  脑组织石蜡切片的制备：每组分别于脑缺血再灌注12 h、24 h、48 h时实施麻醉，打开胸腔，于右心耳部剪一小口，从左心室插入导管，向内缓慢注入PBS缓冲液至右心耳流出液变清，然后注入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液500 ml，灌流30 min后断头取脑，除去小脑和脑干，放入相同固定液中固定1 W，取视神经交叉后冠状面2～8 mm间双侧脑组织，石蜡包埋。制备海马及颞叶5 μm冠状面切片，置于4℃冰箱保存备用。

    1.3.2  HE染色:切片经常规脱腊、梯度酒精脱水、苏木素及伊红染色、二甲苯透明中性树脂封片后置镜下观察。HSP70染色严格按照常规SP法对切片标本进行染色，DAB显色，蒸镏水洗、脱片、封片。阳性染色为细胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒。

    1.4  统计方法

    每张切片均在高倍视野下（40×）随机取海马CA1区4个视野计数神经元细胞中阳性细胞数。实验数据用 x±S表示，采用SPSS15.0统计软件对实验结果进行方差分析及组间差异比较，P＜0.05为有显著性意义。

    2  结果

    2.1  生命体征变化

    I/R组和G组家兔均于缺血后即出现口唇、牙龈及眼结膜苍白，再灌后快速恢复红润。I/R组家兔在缺血5 min内出现呼吸紊乱，心率由快变慢并可出现停跳，死亡率高；G组家兔明显表现缺血耐受，在缺血5 min内呼吸、心率无明显改变，死亡率下降。Sham组家兔无明显改变。

    2.2  形态学变化

    Sham组:海马细胞排列整齐，分3～4层，细胞大而圆，核膜完整、清晰，染色质分布均匀，HE染色较深。I/R组：细胞排列紊乱，细胞体积变小，细胞皱缩，胞核变形呈三角形，HE染色变淡。G组：神经细胞胞膜相对完整，核膜清晰，细胞形态基本正常（图1～3）。

    2.3  免疫学变化

    阳性表达信号为棕黄色颗粒，出现在神经纤维和神经元胞浆或胞核中。在脑缺血5 min分别再灌注12 h、24  h、48 h组中，I/R组和G组双侧海马及颞叶皮质内均可见不同程度的HSP70阳性神经元表达，24 h时达到高峰。G组与I/R组相比，各时间点HSP70表达增多（图5～10），比较有显著性差异 (再灌12h组 P<0.01；再灌24h、48h组P<0.05)；两组的阳性细胞数随再灌注时间延长呈先上升后下降的趋势，在24 h时达到高峰;再灌注24 h与12 h、48 h组间比较有显著性差异(P<0.05)；Sham组未见表达（图4）。三组中海马CA1区HSP70的表达情况见表1。  表1三组中海马CA1区HSP70的表达情况

    3  讨论

    “四管闭塞法”实现全脑缺血，最早由Pulsinelli和Brierley等建立，是目前国际公认的脑缺血模型制备方法，适用于神经保护药物的研究［3］。不同脑区神经元对缺血的敏感性或耐受性不同，其中海马CA1区对缺血性损伤最为敏感，故本实验观察范围主要针对海马CA1区神经元及其周围的胶质细胞。

    脑缺血再灌注时可产生一系列分子生物学变化，在某些神经细胞内应激诱导一些特殊基因的表达，合成一些新的蛋白质，对细胞的损伤产生自身保护作用，其中HSP70就是脑缺血引起的一种应激蛋白。有实验证明［4］，当脑血流量下降至正常水平的50%时，缺血区域始有HSP70的合成，可见缺血缺氧是诱导神经细胞内HSP70基因表达的重要因素。作为脑缺血损伤时敏感且又可靠的分子生物学标志，HSP70不仅在缺血早期对脑细胞有保护作用，抵抗进一步致死性损伤，而且在缺血后期对细胞的修复还起重要作用［5］,目前认为其机制可能为［6］：通过抗氧化作用调节其他蛋白质的合成，维持细胞固有蛋白质的形态结构，促进缺损蛋白质的修复；影响糖皮质激素的释放及代谢，干扰宿主的炎症反应。

    本实验结果发现，假手术组HSP70表达水平很低，呈阴性或弱阳性；I/R和G组HSP70阳性表达明显增加，在神经元胞浆和胞核内均可见阳性表达，且阳性细胞数量随再灌注时间延长呈先上升后下降的趋势，在24   h达到高峰后表达开始下调，说明HSP70在全脑缺血再灌注中损伤中随灌注时间的延长而表达增强，24 h时达到高峰，然后其表达逐渐减少；再灌注48 h时阳性表达明显低于24 h时，组间比较统计结果有显著性差异（P<0.05），这种阳性细胞的表达趋势恰好应证了HSP70高表达是对脑缺血的一种保护因素，同时亦是缺血后组织损伤的早期标志，HSP70的存在意味着损伤尚处于可恢复阶段［７］。通过对本实验结果的分析，显示全脑缺血再灌注后家兔脑组织HSP70的高表达是脑组织对缺血损伤的一种保护机制，在减轻缺血性脑损伤的环节中起重要作用。

    本实验中G组与与I/R组比较，统计结果有显著性差异（P<0.05），提示秦艽水煎液在脑缺血再灌注损伤时能显著上调HSP70的表达，据此推测秦艽可以通过促进HSP70蛋白的合成，从而达到对脑损伤的保护作用，本实验上述结果尚未见报道。

    由于脑缺血再灌注后存在复杂的病理机制，而HSP70蛋白的表达与调节受多种因素的影响。本实验结果显示秦艽可以通过上调HSP70的表达起到脑保护作用。但其究竟如何上调HSP70的表达，是直接作用还是通过其他途径的间接作用，还有待进一步研究。

【文献】
  ［1］ 胡建鹏,王键,李净. 益气活血方对脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡及 HSP70 蛋白表达的影响［J］.实验方剂学杂志, 2005,11(2):72-73

［2］ Pulsinelli WA,Buchan AM.The four-vessel occlusion rat model;method for complete occlusion cerebral arteries and control of collateral circulation.Stroke,1998,19(7):913

［3］ 吴忧，贾建平.脑缺血动物模型的制备及影响因素［J］.中国脑血管病杂志,2007,4(1):42-46

［4］ 苏志强，刘亢丁，铙明俐.大鼠局灶性脑缺血再灌注后HSP70表达及其mRNA变化［J］.中风与神经病杂志,2000,17:8-10

［5］ 冯春生, 麻海春,岳云，等.丙泊酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注时脑组织HSP70和蛋白表达的影响［J］.临床麻醉学杂志.2006，3（22）:207-210

［6 ］马宏仲,薛荣亮.热休克蛋白与脑缺血再灌注损伤［J］.国外医学·麻醉学与复苏分册,2004,25(1):20-21

［7］ Kato H，Kogure I．Boiehemieal and molecular characteristic of the brain with developing cerebral infarction．Cell Mol Neurobiol，1999，19 (1)：93-108