间歇低氧幼鼠8-异前列腺素F2α变化及芹菜素的干预效果

              作者：周永海，蔡晓红，张存雪，李源，李宁，龚永生，胡良冈 

【关键词】  间歇低氧；8-异前列腺素F2α　；芹菜素

    Abstract:  Objective: To detect the changes of 8-iso-prostaglandin F2α (8-ISO-PGF2α) in serum and the hippocampus and to observe the intervention effect of apigenin in immature rats exposing to intermittent hypoxic. Methods: Thirty two 3～4 week-aged SD rats were randomly divided into intermittent hypoxia (IH) group，air control(C) group，apigenin+ DMSO (Q) group and DMSO control(R) group. Each group had eight rats. Intermittent hypoxia model was induced by an intermittent hypoxia cabin and the cabin was flushed with 99.99% nitrogen alternating with 99.5% oxygen. The cycle of hypoxia- reoxygenation was 90 s. After 2 weeks，the serum and hippocampus levels of 8-Iso-Prostaglandin F2αwere tested by ELISA. Results: In the serum，the expression of 8-ISO-PGF2α in IH and R groups were significant higher than that in C and Q groups (P <0.01，respectively). There were no difference between C and Q groups (P >0.05)，and no difference between IH and R groups (P >0.05). The similar results were found in hippocampus. Serum 8-ISO-PGF2α and hippocampus 8-ISO-PGF2α were positively correlated (r =0.818，P <0.01). Conclusion: The 1evels of 8-iso-PGF2α increases in both serum and hippocampus of immature rats with IH and the 1evels of 8-iso-PGF2α in serum can reflect indirectly the degree of oxidative stress in hippocampus. Apigenin can reduce the 1evel of 8-iso-PGF2α in serum and hippocampus. Therefore，it has plication prospect in treatment of injuries which induced by IH.

    Key words:   Intermittent hypoxia；8-ISO-PGF2α；Apigenin

    儿童睡眠障碍阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)可造成神经系统损害，从而引起认知功能障碍、学习成绩下降，其危害逐渐引起社会的广泛关注。目前认为OSAHS最重要的病理生理改变是夜间反复的间歇低氧，进而引起机体氧化应激。芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，能清除氧自由基及NO自由基等，从而体现了对神经的保护作用[1]。本试验模拟OSAHS的典型病理生理特征，建立慢性间歇低氧的幼鼠模型，测定血清及海马中8异前列腺素F2α水平，并观察芹菜素的干预作用，以期为临床应用芹菜素间歇低氧造成的损伤提供实验基础和理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  动物与药品  取体重为80～100 g健康雄性SPF级SD幼鼠(3～4周龄)32只，由温州医学院实验动物中心提供，合格证号：SYXK(浙)2005-0061。芹菜素纯度为98%，批号：060313（陕西慧科植物开发有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）批号：040602（上海生工生物工程技术服务有限公司）。芹菜素配制方法：25 mg芹菜素+8 ml生理盐水+40μl DMSO，配成11.6×10-3μmol/L，4 ℃冰箱保存。溶剂配制方法：8 ml生理盐水+40μl DMSO，配成0.5%的溶剂，4 ℃冰箱保存。

    1.2  仪器  CYES?蛐脱酢⒍?趸?计?宀舛ㄒ怯缮虾＜味ㄑЯ?潜沓?峁??湫?脱醪蘸涂掌?Ｄ舛哉詹兆灾疲ㄖ魈逵刹恍飧种瞥桑?崭侵屑洳糠治?ＡВ黄?甯制俊⒓跹狗А⒘髁考啤⒖刂瞥绦颉⒓痰缙鳌⒌绱欧Ш拖允酒鞯茸槌煽刂葡低场＜湫?脱醪?25 cm×48 cm×24 cm大小，侧壁上有4个进气的单向阀，4个排气的单向阀；空气模拟对照舱60 cm×48 cm×24 cm大小，侧壁上有2个进气的单向阀，2个排气的单向阀），电磁阀由宁波亚德客自动化有限公司提供，单片机选用华邦（Winbond）的W78E516B八位单片机，医用压缩氧气(浓度>99.5%)和压缩高纯度氮气(浓度>99.99%)由温州市医用氧厂提供。

    1.3  动物模型建立及分组  参照McGuire、Gozal等[2，3]方法建立慢性OSAHS动物模型。取3～4周龄雄性幼鼠32只，按数字表法随机分为间歇低氧组（IH），空气对照组（C），芹菜素+DMSO组(Q)和二甲基亚砜组(R)，每组各8只。IH、R、Q组置于常压间歇低氧舱内。90 s为一次低氧?囱跹?罚??.3 kPa压力通氮气30 s、停30 s，25 L/min流量通氧气12 s、停18 s，在停止通气阶段由连接的测氧仪分别测间歇低氧舱内的氧浓度高值、低值和CO2 浓度，CO2 浓度始终<0.01%，湿度为（50±10）%。每天7.5 h (8:50-16:20)。C组幼鼠置于同等条件下的空气模拟对照舱，通压缩空气，与间歇低氧舱由同一单片机程序控制气体输入。Q组幼鼠每天于常压低氧前30 min腹腔注射25 mg/kg[4]用DMSO溶解的芹菜素，R组则注射同量DMSO+生理盐水。幼鼠自由活动，不限饮食，实验时间为2周。

    实验过程中，白天各舱上面均盖厚布，使舱内保持黑暗，模拟黑夜，幼鼠进入睡眠状态。每天间歇低氧结束后，幼鼠出舱，置于日光灯下，模拟白天，自由活动，饮食不限。

    1.4  血清及海马8-ISO-PGF2α测定  低氧结束次日，戊巴比妥钠（35 mg/kg，腹腔注射）麻醉，将幼鼠仰卧固定，剖开腹腔，抽取腹主动脉血3 ml，低温离心机4 000 r/min离心15 min，取上清，-20 ℃保存待测；取血后迅速断头处死幼鼠，取出海马，留取100 mg，用磷酸缓冲液反复冲洗干净后-80 ℃保存待测。ELISA试剂盒购自美国Assay designs公司，按照试剂盒说明书操作，用CurveExpert1.38软件绘制标准曲线，各孔相应8-ISO-PGF2α浓度。批内和批间变异系数分别为6.5%和7.8%，最低可测范围为40 pg/ml。

    1.5  统计学处理方法  采用SPSS12.0统计软件。用单因素方差分析，方差齐者组间比较用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane’s T2 检验。两变量的相关分析用Pearson 直线相关分析法。

    2  结果

    2.1  各组幼鼠血清与海马中8-ISO-PGF2α的含量结果  见表1。

    2.2  血清和海马组织中8-ISO-PGF2α含量的相关分析  两者呈显著正相关（r =0.818，P＜0.01，n =64）结果见图1。

    3  讨论

    睡眠是人生命的重要组成部分，儿童睡眠障碍以OSAHS为多见，发病率约为2%。OSAHS患儿存在一定程度的执行能力、注意力、记忆力和言语能力下降[5]；有研究发现，虽经鼻持续气道正压通气(nCPAP)、口咽部手术等方法治疗，OSAHS患者受损的学习记忆等认知功能也只能得到部分改善[6, 7]，因此，如何早期便捷、有效地判定OSAHS所致的间歇低氧脑损伤程度及探寻一种新的方法来进行防治具有重要意义。

    OSAHS特征性的低氧方式是慢性间歇低氧，这种低氧/复氧方式出现类似缺血/再灌注过程中的病理变化，产生大量的活性氧（ROS），引起机体氧化应激。由于ROS过量生成，一方面导致超氧阴离子(O2-)、过氧化氢（H2O2）等氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，将膜磷脂、DNA氧化，将酶蛋白变性，从而对细胞产生多种毒性作用[8]。由于中枢神经组织含有丰富的脂质成分而且抗氧化酶相对缺乏、耗氧量高，所以对自由基损伤特别敏感，对氧化应激具有独特的易损性，易导致脑损伤及海马等处神经细胞凋亡[9]。

    8-ISO-PGF2α是近年来新发现的具有生物活性的一类拟前列腺素样物质，由自由基损伤细胞膜脂质花生四烯酸发生脂质过氧化而产生，是异前列腺素类物质中含量最多、性质最稳定的一种具有生物活性的拟前列腺素物质。在体内，8-ISO-PGF2α的合成不依赖环氧酶催化，在体液内含量非常稳定，故被认为是判断活体内自由基氧化强度和临床上作为评价抗氧化剂疗效的最理想的生化指标[10]。临床研究显示，持续低氧时，脑脊液甚至脐血的8-ISO-PGF2α都明显增高，并且与病情的严重程度密切相关[11]。本研究结果显示，IH组的血清及海马中8-ISO-PGF2α含量明显高于C组，证明间歇低氧后，幼鼠机体不仅发生了系统性氧化应激，亦发生了局部性氧化应激，血清和海马组织中8-ISO-PGF2α表达呈显著正相关，证实血清中的8-ISO-PGF2α水平能够作为评价间歇低氧脑部氧化应激损伤的评价指标。

    芹菜素是一种天然的抗氧化剂，我们此前的研究发现，芹菜素可保护间歇低氧幼鼠海马神经元，从而改善其学习记忆能力的损伤[12]。本研究发现，Q组的8-ISO-PGF2α表达则明显低于R组，证明芹菜素可在抑制间歇低氧所致的氧化应激过程中发挥重要作用，R组与IH组之间无差异，因此这种对氧化应激的抑制确实是芹菜素而非它的溶解剂DMSO所致。由于芹菜素是一种很强的金属离子螯合剂（例如铁和铜离子），亦可以抑制A型单胺氧化酶（type A monoamine oxidase，MAO-A）的活性[13]，因此推测芹菜素抑制间歇低氧所致的脑部氧化应激损伤机制可能是通过螯合作用来降低金属离子参与的自由基反应，减少氧自由基的生成以及介导单胺的分解代谢达到神经保护的作用。

【】
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