氯胺T法标记B7-2单抗6C8的方法学研究

             作者：文正伟，章斌，苏成海，吴星红 

【摘要】  目的: 建立125I标记B7-2单抗6C8的方法，探讨其最佳标记条件。方法: 氯胺T法标记单抗6C8，改变标记条件：抗体的量分别为3μg、6μg、9μg、12μg；125I的活度分别为0.925 MBq、1.85 MBq、3.7 MBq、7.4 MBq、14.8 MBq；CH-T的量分别为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg；反应时间分别为30 s、1 min、2 min、4 min；每次实验均重复3次，根据实验结果调整标记条件。标记好后，找出最佳标记条件，在生理盐水和人血清中分别作不同时间的标记率稳定性测定，以30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h为时间点，选出标记率最高的时间点。纸层析法测定标记率及放化纯。结果: 抗体量对标记率没有影响；Na125I 3.7 MBq时标记率为（74.53±5.12）%，放化纯为（90.40±3.01）%；CH-T 20μg时标记率为（81.00±14.75）%，放化纯为（95.17±4.45）%；反应时间30 s时标记率为（80.67±13.32）%，放化纯为（88.93±10.16）%。室温下放置3 d标记率为(83.12±8.47)%，加入人血清后放置24 h标记率为（5.23±0.90）%。结论: 上述氯胺T法最佳标记条件为：Na125I 3.7 MBq，氯胺-T 20μg，6C8抗体6μg，Na2S2O5 100μg，反应时间30 s。该方法具有较高的标记率和较差的稳定性。

【关键词】  碘；同位素标记；抗原，CD80；抗体，单克隆

    Abstract:  Objective: To establish a method for labeling monoclonal antibody 6C8 of B7-2 with chloramine T and to discuss the best labeling conditions. Methods: Labeling monoclonal antibody 6C8 with chloramine T， and several labeling conditions were  used for tests. The quantity of antibody was 3 μg，6 μg，9 μg and 12 μg，respectively；the activity of 125I was 0.925 MBq，1.85 MBq，3.7 MBq，7.4 MBq and 14.8 MBq，respectively and the weight of CH-T was 10 μg，20 μg，30 μg，40 μg，50 μg and the reaction time was 30 s，1 min，2 min and 4 min. Each experiment repeated three times. Labeling conditions were regulated according to the experiment results until the best conditions were found. Then the stability of labeling rate was detected in PS and human serum， and the time was seleced when the labeling rate was the highest. Paper chromatography was used for measuring the labeling rate and radiochemical purity.Results: The quantity of 6C8 had no impact on labeling rate. When Na125I was 3.7 MBq， the labeling rate and radiochemical purity was（74.53±5.12）%  and（90.40±3.01）%，respectively. When CH-T was 20 μg，those was（81.00±14.75）% and（95.17±4.45）%，respectively. When the reaction time was 30 s，the labeling rate and radiochemical purity was（80.67±13.32）% and（88.93±10.16）%，respectively. The rate of labeling was (83.12±8.47) % when the labeling antibody in room temperature was tested 3 days later. The labeling antibody in human serum was tested after 24 hours， its’labelling rate was （5.23±0.90）%. Conclusion: The best labeling conditions are: Na125I 3.7 MBq，CH-T 20μg，6C8 6μg，Na2S2O5 100μg and reactive time 30 s. The method has high labeling rate but low stability.

    Key words:   iodine；isotope labeling；antigens，CD80；antibodies，monclonal

    T细胞的活化、增殖继而发挥其作用至少需要两个信号的参与[1，2]：一是T细胞表面的TCR-CD3复合物同抗原递呈细胞（APC）上的MHC-Ⅱ类抗原肽复合物结合，赋予免疫应答的特异性，但不引起T细胞的增殖和分泌细胞因子；二是抗原非特异性的共刺激信号，由T细胞上的共刺激分子与APC表面的配体结合所诱导，启动维持并调节活化级联反应，决定了T细胞是活化增殖或转变为无反应状态甚至凋亡。B7-CD28/CTLA-4是研究最广泛的T细胞共刺激分子[3，4]，而在B7家族中，B7-1、B7-2研究得最为广泛。B7-2属于免疫球蛋白超家族成员，由303个氨基酸残基构成，胞外220个氨基酸残基，跨膜区有23个氨基酸残基，胞内有60个氨基酸残基，胞外区含有两个Ｉg样功能区，和8个潜在的糖基化位点。某些肿瘤细胞上也存在B7-2的高表达。本研究用125I采用氯胺T法标记B7-2，并对影响标记率的各种条件进行了实验研究，现报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料  Na125I（购自成都中核高通同位素股份有限公司）；CH-T（购自Sigma公司）；Na2S2O5（Fluka）；Sephadex G50柱（GE Healthcare Bio-sciences AB ）；6C8抗体（购自苏州大学生物技术研究所）；Na2HPO4.12H2O（购自上海化学试剂有限公司）；NaH2PO4.2H2O（SCRC国药集团化学试剂有限公司）；放免γ测量仪(购自SN-695B上海核子所日环光电仪器有限公司)；CRC-15R型放射性核素活度计 (CAPINTEC USA)。

    1.2  方法

    1.2.1  标记方法：用0.05 mol/L、pH值7.5的PB液配置氯胺T溶液（1 g/L）和Na2S2O5溶液（1 g/L）。取2μl的6C8抗体（3 g/L）于EP管，置于4 ℃冰箱中；依次向EP管中加入14.8 MBq的Na125I溶液、50 μl 0.05 mol/L的PB液和50μl氯胺T溶液；立即在电磁搅拌器搅拌下反应1 min；迅速加入100μl Na2S2O5（1 g/L）溶液终止反应。

    1.2.2  分离纯化:向Sephadex G50柱中加入0.05 mol/L pH值7.5的PB液2 ml平衡柱子，待平衡液全部流入柱中后，加入反应液；待反应液全部流入柱床后，用0.05 mol/L pH值7.5的PB液洗脱，流速为每滴5 s；流出液收集于EP管中，每管收集0.5 ml。收集液逐管在放射性核素活度计内测量，合并第1个放射性峰位的溶液即为125I-6C8抗体产品峰，其余溶液倒入废液回收瓶；继续用0.05 mol/L、pH值7.5的PB液洗脱，直至淋洗流出液在活度计内测量活度接近本底再倒入废液瓶。 

    1.2.3  标记率测定:取反应管内的标记液和125I-6C8抗体产品峰各3～5μl，采用新华1号层析纸作固定相在生理盐水中展开，毛细管点样在层析纸的原点处，进行标记率和放化纯的测定。第一峰为125I-6C8抗体产品峰，第二峰为游离的125I峰。反应管中的标记液用作标记率的测定，标记率=层析纸中125I-6C8抗体产品峰的放射性计数率/（125I-6C8抗体产品峰的放射性计数率+游离125I峰的放射性计数率）×100%。分离纯化的125I-6C8抗体产品峰洗脱液用作放化纯的测定，放化纯=层析纸中125I-6C8抗体产品峰的放射性计数率/（125I-6C8抗体产品峰的放射性计数率+游离125I峰的放射性计数率）×100%。

    1.2.4  125I标记6C8抗体的方法学研究：改变抗体的量，分别为3μg、6μg、9μg、12μg，其余条件固定不变；改变125I的活度，分别为0.925 MBq、1.85 MBq、3.7 MBq、7.4 MBq、14.8 MBq，其余条件固定不变；改变CH-T的量分别为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，其余条件固定不变；改变反应时间，分别为30 s、1 min、2 min、4 min、8 min，其余条件固定不变；每次实验均重复3次，根据实验结果调整标记条件。标记好后，找出最佳标记条件作不同时间的标记率稳定性测定，以30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h为时间点，选出标记率最高的时间点。

    1.2.5  标记物稳定性分析：室温下将10μl标记物加入到200μl人血清或生理盐水中，10μl标记物作为对照组。加入1 h、2 h、4 h、6 h、24 h后，分别进行标记率的测定。

    1.3  统计学处理方法  采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，组间两两比较采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  抗体量对标记率、放化纯的影响  当抗体量为3μg、6μg、9μg、12μg时，标记率分别为（72.33±9.29）%、（82.00±7.93）%、（79.16±6.33）%、（84.56±5.09）%；放化纯分别为（92.00±3.00）%、（88.33±5.77）%、（89.93±1.43）%、（87.52±4.36）%。两个指标各组间差异均无显著性(均P >0.05)。

    2.2  125I的活度对标记率、放化纯的影响  当125I的用量分别为0.925 MBq、1.85 MBq、3.7 MBq、7.4 MBq、14.8 MBq时，标记率分别为（68.81±2.89）%、（66.88±3.14）%、（74.53±5.12）%、（73.93±5.77）%、（82.00±7.93）%；放化纯分别为（77.42±14.18）%、（75.65±19.71）%、（90.40±3.01）%、（90.26±1.91）%、（88.33±5.77）%。放化纯各组间差异无显著性（均P >0.05)。标记率14.8 MBq与1.85 MBq、0.925 MBq间差异有显著性(均P <0.05)，其余各组间差异无显著性（均P >0.05)（见图1）。

    2.3  CH-T的用量对标记率、放化纯的影响  当CH-T的量分别为50μg、40μg、30μg、20μg、10μg时，标记率分别为（83.80±6.09）%、（82.27±4.40）%、（81.17±4.59）%、（81.00±14.75）%、（68.80±3.32）%，CH-T的量50μg与10μg差异有显著性（P <0.05)，其余各组间差异无显著性。放化纯分别为（90.40±3.01）%、（90.03±6.24）%、（92.13±4.46）%、（95.17±4.45）%、（95.53±2.16）%，各组间差异无显著性（均P >0.05)（见图2）。

    2.4  反应时间对标记率和放化纯的影响  当反应时间为30 s、1 min、2 min、4 min时，标记率分别为（80.67±13.32）%、（85.73±1.48）%、（88.33±15.40）%、（86.93±17.18）%；放化纯为（88.93±10.16）%、（95.87±2.78）%、（91.50±7.53）%、（94.20±3.99）%，各组间差异均无显著性（均P >0.05)（见图3）。

    2.5  放置时间对标记率的影响  当放置时间分别为30 s、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h、3 d、7 d、30 d时，标记率分别为（95.87±2.78）%、(97.13±2.59)%、(93.10±3.32)%、(97.43±2.69)%、(96.23±3.15)%、(91.50±1.20)%、(83.93±1.82)%、(83.12±8.47)%、(47.57±42.19)%、(49.00±2.00)%，时间7 d、30 d与30 s、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h、3 d间差异有显著性（均P <0.01)（见图4）。

    2.6  标记物的稳定性  标记产物加入生理盐水或人血清后1 h、2 h、4 h、6 h、24 h的标记率（见表1、图5）。人血清组和生理盐水组在2 h至4 h下降明显，但对照组24 h前却相对较稳定。

    3  讨论

    B7-2既参与T细胞的活化、免疫应答的维持与调节[5]，同时也参与B细胞介导的免疫应答[6]。体外实验发现，阻断共刺激信号，可诱导T细胞特异性免疫耐受的产生，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体移植排斥的防治。研究报道，B7-2拮抗剂已被运用于抗移植排斥和自身免疫性疾病的中，取得了令人满意的结果[7-10]。有实验证明，用抗B7-1的单抗可以改善变应性脑脊髓炎（EAE），抗B7-2单抗可以阻止病情的恶化。

    B7-2表达于多数APC细胞的表面，如巨噬细胞、树突样细胞、及活化的B细胞和何杰金氏病的R～S细胞、滤泡性淋巴瘤的恶生细胞、黑色素瘤细胞、人肝癌细胞系、肾细胞癌的TIL、类风湿性骨关节炎滑膜液中的T细胞、皮肤的朗罕细胞等。另外有人发现，可溶性的B7-2分子在系统性红斑狼疮和哮喘患者的血清样本中的含量也有显著提高[11，12]。

    氯胺-T标记6C8实验中，氯胺-T是一种强氧化剂，对抗体的免疫活性有直接影响，其影响程度与氧化剂的用量及反应时间有关。标记的基本原理是将125I-氧化为125I2，再和酪氨酸残基苯环上的羟基邻位发生亲碘取代反应，如下式。

    本实验中反应时间对标记率的影响不大，但考虑到抗体的活性，我们取最短的反应时间。氯胺-T的用量越大标记率越高，但用量过大会影响标记物的生物活性和免疫活性（理论上氯胺-T 0.15μg可以氧化74 MBq的新鲜125I-[13]），在我们的实验中，当用量小于20μg时，标记率明显降低。因此，在我们的反应体系中，20μg氯胺-T为比较好的选择。为了防止过量氯胺-T氧化抗体等物质，我们参照报道加入Na2S2O5 100μg，以还原多余的氯胺-T。反应体积小，有利于反应的进行，但太小不利于操作，太大又减少了分子间碰撞的机会，不利于氧化反应[14]，资料后，我们选择反应体积在200～300 μl间。由于抗体和125I较昂贵，且不同用量的标记率差异无显著性，我们尽可能减少用量，但由于实验条件限制，3 μg抗体不利于操作，而稀释浓度又会导致反应体积增大，因此我们认为抗体量6 μg为最佳，同时，本实验最终目的是作免疫放射分析，对放化纯要求高，所以我们选放化纯最高时Na125I的用量为最佳用量。综上所述，最佳实验条件为：Na125I 3.7 MBq、氯胺-T 20μg、抗体6C8 6μg、Na2S2O5 100μg、反应时间30 s、总体积为200～300μl。

    用该方法标记出来的抗体放置在室温中时，在3 d的时间内，其标记率均比较稳定，但7 d后，标记率明显下降，说明随时间延长，标记物脱碘现象明显。对于制作试剂盒来说，尚需要进一步寻找贮存标记物的方法。标记物加入到生理盐水、人血清中，是为了观察在pH值为7.4及与人体内环境相似的情况下，在金属离子和血清中各种酶的影响下，标记物的标记率是否稳定。我们发现在2 h至4 h之间，标记率明显下降，原因不清楚。

    本实验建立了125I标记B7-2抗体的方法学研究，125I标6C8可以用来作为滤泡性淋巴瘤、黑色素瘤细胞、人肝癌细胞系、肾细胞癌的放射免疫治疗，也可用来做某些自身免疫性疾病病人血清的免疫放射分析。用131I代替125I标记B7-2抗体，可用来做某些肿瘤的显像和治疗。125I标记B7-2抗体具有非常广泛的临床应用前景。

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