低频脉冲电针对慢性根性痛大鼠背根神经节P物质的影响
作者：屠文展，蒋松鹤，楼新法，张瑞峰，刘芬，庞玲霞，李莎莎
【摘要】 目的:探讨局部及肢体远端不同穴位低频脉冲电针对慢性根性痛大鼠背根神经节P物质（sP）的影响。方法:复制慢性根性痛大鼠模型。将25只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、局部电针组（取双侧L4“夹脊”穴）、远端电针组（取双侧“阳陵泉”穴）及远近结合电针组（取双侧L4“夹脊”穴＋双侧“阳陵泉”穴）。通过免疫组化法，观察比较患侧背根神经节sP表达的变化。结果:与模型组相比，正常组、电针组患侧背根神经节sP的表达均减少（P <0.05）。各电针组之间，远近结合电针组患侧背根神经节sP的表达较局部电针组、远端电针组减弱（P <0.05）。结论:低频脉冲电针的镇痛作用可能部分是通过抑制sP的合成实现的。与局部电针组和远端电针组相比，远近结合电针组抑制sP的合成作用较强。
【关键词】 低频脉冲；电针；P物质；慢性根性痛；脊神经节
Abstract: Objective: To investigate the effect of substance P in dorsal root ganglion treated with low frequency transduction pulse electro-acupuncture on different acupoints of local and distant limbs of the chronic radicular pain rats. Methods: The model of rat with chronic radicular pain was adopted and 25 maleness Wistar rats were divided into three groups randomly， including normal control group， model group，local acupoints needling group（choose GB34 Yanglingquan at each side），distant acupoints needling group（choose EX-B2 Jiaji at each side of L4）；distant and local coordination of acupoints needling group （choose GB34tYanglingquan at each side and EX-B2 Jiaji at each side of L4）. The changes of the expression of substance P in the dorsal root ganglion were observed by the immunochemistry. Results : Compared with the model group， the expression of substance P in the dorsal root ganglion in the normal control group and electroacupuncture groups were lower significantly (P <0.05)．Among the electroacupuncture groups， the expression of substance P in distant and local coordination of acupoints needling group were lower significantly (P <0.05) compared with local acupoints needling group and distant acupoints needling group. Conclusion: The analgesia effect of low frequency transduction pulse electro-acupuncture is realized by suppressing the synthesis of substance P to some extent. Compared with local acupoints needling group and distant acupoints needling group，distant and local coordination of acupoints needling group effects better in inhibiting the synthesis of substance P.
Key words: low frequency transduction pulse electroacupuncture；substance P；chronic radicular pain；immunochemistry；ganglia
低频脉冲电针是将物理医学与中医针灸学相结合慢性腰腿痛的有效而副作用极少的一种手段。已有大量动物实验证实低频脉冲电针是通过调节神经递质的表达和释放而起到镇痛作用。P物质(substance P，sP)，是其中较为重要的一种[1，2]。但电针对于其中较为复杂的慢性根性痛模型（类似于人体的腰椎间盘突出症）的神经递质表达影响少见报道，尤其是局部取穴法和远道取穴法电针镇痛效果孰优及其结合应用价值的实验数据鲜见报道。
本研究通过不同配穴[3]的电针干预慢性根性痛大鼠模型，观察根性压迫的局部及肢体远端等不同部位穴位电刺激所引起的背根神经节内sP表达是否存在差异。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 雄性Wistar大鼠30只（由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供），体重150～200 g，基础痛阈为（5.0±1.3）s，随机分为正常对照组（A组）、模型组(B组)、局部电针组（C组，取双侧L4“夹脊”穴）、远端电针组（D组，取双侧“阳陵泉”穴）和远近结合电针组（E组，取双侧L4“夹脊”穴＋双侧“阳陵泉”穴），以上各组均为5只。取穴标准见李忠仁主编的《实验针灸学》[4]。
1.2 主要试剂 免疫组化SP一抗（calbiochem公司产品），购自上海西格玛奥德里奇生物技术有限公司，SABC（兔IgG）-POD试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司产品），其他试剂均为国产化学纯。
1.3 动物模型复制 参照[5]复制腰神经根压迫模型。经10%水合氯醛腹腔麻醉（0.5 g/kg）后，在手术显微镜下咬除L4、5棘突、右侧椎板和关节突，暴露并游离出右侧L4脊神经背根，在接近背根神经节（DRG）近侧端处用内径为1 mm的硅胶管，纵行切开，套入L4脊神经背根，在硅胶管外用丝线结扎，缝合切口，动物存活4周。
1.4 电针方法 动物术后4周，将电针组大鼠固定在特定筒架上，按要求取穴进针后，用韩氏治疗仪通电给予刺激，频率2 Hz，强度以引起大鼠肢体轻度抖动为宜(≤2 mA)，持续30 min，每日同一时段连续电针8 d。
1.5 标本制备及sP检测 造模后35 d（即电针组电针8 d后）各组大鼠经10%的水合氯醛液（0.75 g/kg）腹腔麻醉，开胸暴露心脏，经左心室灌流固定。先用150 ml生理盐水快速灌流冲洗血液，继以4%多聚甲醛400 ml(用0.1 mol/L PBS缓冲液配制，pH 7.4)持续灌注1 h左右。取患侧L3～5背根神经节后，固定2 h（4 ℃），放入含20%蔗糖的PB溶液中过夜至组织块沉底，冰冻切片，片厚10μm，间隔取片，贴片后切片置-80 ℃冰箱内保存，免疫组化法检测sP。SP免疫组化染色按照说明书操作。
1.6 图像分析及统计学处理方法 利用Image-Pro Plus 5.1图文分析系统对结果进行机图像分析处理，每个样本取5个视野，测定累积光密度IOD值,将这五个数值取均数代表此例动物该侧背根神经节IOD值，作为sP的相对含量。用SPSS13.0 统计软件进行统计。各检测指标的组间数据用单因素方差分析和LSD检验。
2 结果
背根神经节SP染色显示：典型的sP阳性神经元为胞浆有棕褐色颗粒，胞核不染色，以中小神经元为主。B组大鼠脊髓背根神经节中的阳性反应神经元数量增多，中小神经元的阳性反应呈深棕色颗粒(++)IOD值增高。C、D、E组阳性反应神经元数量较B组减少，IOD值相应减低，较A组增多。E组IOD值较C、D组降低。见表1。
3 讨论
3.1 关于动物模型 本实验所制备的慢性根性痛大鼠模型稳定，L4神经根压迫部位HE染色的慢性炎症表现及行为学步态情况[6]，与临床腰椎间盘突出压迫神经根患者的病理和临床症状相似。
3.2 sP与痛觉传递 背根神经节细胞分三种类型：大细胞（>50μm）、中细胞（25～50μm）、小细胞(<25μm)。其中大型神经元主要发出粗的有髓纤维(Aa/Aβ)，在传递非伤害性感受和抑制伤害感受中起着重要作用；中、小型神经元主要发出细髓的Aδ纤维和无髓的C类纤维，主要作用是传递伤害性感受，因而认为其与痛觉的传递密切相关。sP在背根神经节内合成，其轴突(细纤维)投射在脊髓背角浅层，外周伤害性刺激能增加sP在脊髓背角浅层释放，激活神经激肽受体，参与疼痛信息的传递[7]。定量研究显示，6%～2O%大鼠DRG细胞呈sP免疫反应阳性，其中大多数是中小型细胞[8]。从本实验结果看，造模后大鼠患侧背根神经节sP免疫阳性反应物表达较正常组增加，表明伤害性刺激致使sP在背根神经节内合成增加；2 Hz脉冲电针后患侧背根神经节sP免疫阳性反应物表达较模型组明显降低，较正常组表达增强，表明2 Hz脉冲电针减轻根性痛可能是通过抑制sP合成而阻断痛觉信号的传递。
3.3 三种不同配穴电针与sP合成 低频脉冲电针是近将物理医学（理疗学）与中医针灸学相结合的产物。对于背根神经节受压引起的根性痛，针刺能深入局部肌肤，接近深层的靶位，较普通的低频脉冲刺激电极更有优势。局部脉冲电针刺激能引起“局部反馈”的镇痛作用[3]。“闸门控制学说”是早期的假说，进一步的研究证实，根性痛局部部位的电针刺激信息由Aβ(Ⅱ类)和Aδ(Ⅲ类)纤维传入脊髓，通过腹外侧束上传，兴奋了位于中枢神经系统各个层次的“痛觉调制系统”，多层次地阻止伤害信息向大脑皮质痛觉感受区传导[9]。而肢体远端穴位高密集区（远肢优势规律）的针刺镇痛在数千年的针灸中也极为常用，相应的低频脉冲电针的现代应用也颇为频繁。根据神经节段学说，随着胚胎生长分化，不管肢节如何生长，支配它们的神经系统怎样重复排列组合，神经系统与体躯（包括肌肉与皮肤）和内脏之间保持原始的节段联系关系；远离脊柱发育出来的四肢部分，其感觉与运动的神经支配，仍然来源于胚胎时期出芽部位的脊髓节段[10]。电针刺激由腓浅神经及腓深神经分布和支配的“阳陵泉”穴（小腿前侧部），刺激冲动经神经最终传入L4、L5节段整合[11]。本实验的三组电针组间的sP免疫阳性反应物IOD值，E组较C、D组降低，差异有显著性，提示远近结合电针在抑制患侧背根神经节sP合成方面较局部或远端电针而言，有着显著的叠加作用。局部和远端电针组合间痛阈变化率差异无显著性，则可能与电针疗程较短、强度较弱、脉冲电频率等影响因素有关，以及更为敏感的痛域检测，有待今后进一步深入研究。
【】
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