裸鼠皮下前列腺癌模型的建立研究
【摘要】 目的:建立裸鼠皮下LNCaP前列腺癌模型，为前列腺癌动物实验研究提供工具。方法:以每只1×106 LNCaP细胞数与基底膜基质混合注射入5只BALB/c裸鼠前肢腋窝皮下，于第2周至第12周分别检测裸鼠血浆tPSA含量，12 w后处死裸鼠，取皮下肿瘤及相关器官做病理检查，监测肿瘤生长及转移情况。结果:80%(4/5)裸鼠于第8周后在前肢腋窝皮下长出肿瘤，肿瘤包膜完整，病理切片可见典型肿瘤细胞，但5只裸鼠均未发现肿瘤转移；5只裸鼠均可测得血浆tPSA，且血浆tPSA含量随肿瘤生长而升高，其中未长出实体瘤的裸鼠血浆tPSA含量亦随时间推移而升高。结论:成功地建立了裸鼠皮下LNCaP前列腺癌模型。该肿瘤模型能分泌PSA和表达DD3mRNA，能更有效地模拟人前列腺癌的生物学特性。
【关键词】 LNCaP 前列腺癌 皮下模型 裸鼠
Abstract: Objective: To establish a nude mouse model by subcutaneous injection of cell line LNCaP as an useful research tool for human prostate carcinoma. Methods: 1×106 LNCaP cells mixed with Matrigel were subcutaneously injected into armpit of 5 BALB/c nude mice in each mouse. Plasma concentration of tPSA of each mouse was detected from the 2nd week to the 12th week. After the 12th week, the mice were executed. Histopathological examinations of subcutaneous tumors and relevant organs were performed to identify the oncogenesis and metastasis of prostate carcinoma. Results: Subcutaneous tumors in intact membranes had grown in 80% mice (4/5) after 8 weeks. There were lots of typical cancer cells in these tumors observed in pathological section. But there was no metastasis of prostate carcinoma found in all of 5 mice. In plasma of these 5 mice, tPSA can be detected. The test showed that plasma concentration of tPSA rose following upgrade of the size of tumor. And tPSA of the only mouse that has no tumor observed also rose following time advancement. Conclusion: The nude mouse model of human prostate carcinoma with subcutaneous injection of cell line LNCaP which can secrete PSA and express DD3mRNA is established. And it can simulate biological character of human prostate carcinoma more effectively.
Key words: LNCaP；prostate carcinoma；nude mouse
在研究前列腺癌发生、的生物学机制以及评价措施有效性的实验中，各种前列腺癌动物模型成为实验的关键工具。目前在国内，已有众多学者成功建立了各种前列腺癌动物模型，但所用前列腺癌细胞株多以PC-3、DU145等[1，2]为主。而LNCaP细胞株能分泌PSA和表达DD3mRNA，这与人类原发性前列腺癌的生物学表现一致，故LNCaP细胞株更能有效地模拟人前列腺癌的生物学特性，并且能在实验过程中监测肿瘤的形成、生长状况，也为进一步研究DD3基因功能提供实验动物模型。本实验采用了LNCaP细胞与基底膜基质混合注射的方法，成功建立了裸鼠皮下LNCaP前列腺癌模型。
1 材料和方法
1.1 实验动物 雄性BALB/c裸鼠5只，鼠龄为4～6 w，体重为18～20 g，由中科院上海实验动物中心提供。在SPF条件下，饲养裸鼠于层流架内，饲料和饮水均自由摄入且都经过严格灭菌处理。
1.2 前列腺癌细胞株 LNCaP细胞株由中科院上海细胞生物学研究所提供，在5% CO2，37 ℃培养箱中进行常规细胞培养，所用培养液为含10%胎牛血清的F12培养液，以0.05%胰酶和0.53 mmol/L EDTA混合液消化传代。
1.3 试剂 基底膜基质[美国Becton Dickinson公司的Matrigel Basement Membrane Matrix (9 mg/ml,货号为356234)]；Total PSA检测试剂（美国Abbott公司 Achitect i2000仪器配套试剂）。1.4 前列腺癌皮下模型的建立
1.4.1 取处于对数生长期的LNCaP细胞，用台盼蓝染色测存活率并计数。离心收集5×106 LNCaP细胞，置于已预先稀释至5 mg/ml的基底膜基质中，混匀制成1 ml细胞悬液。每只裸鼠分别注射0.2 ml该悬液，其中含有约1×106 LNCaP细胞数。
1.4.2 于SPF条件下，在层流架中抓取裸鼠，做好编号，用75%酒精擦拭裸鼠前肢腋窝处进行接种前消毒。用皮试针以每只裸鼠0.2 ml的悬液量将备好的LNCaP细胞悬液注射入裸鼠的前肢腋窝皮下。
1.4.3 在皮下接种LNCaP细胞后，每天观察肿瘤形成、生长情况并且记录肿瘤直径大小，直至12 w后5只裸鼠陆续出现濒死状态，将其用乙醚麻醉后处死。
1.5 tPSA测定 用断尾取血法分别取得每只裸鼠约0.2 ml全血，离心后得到约0.1 ml血浆；将标本置于仪器Achitect i2000中，用Total PSA检测试剂对其进行定量分析。
1.6 病理检查 在12 w后将裸鼠用乙醚麻醉后处死，剖开肿瘤部位皮肤，观察肿瘤生长及转移情况，先剥离并取出肿瘤，再取肿瘤周围组织及淋巴结，均置于4%多聚甲醛中固定；然后依次剖开裸鼠的颅腔、胸腔、腹腔及阴囊，取出大脑、肺、心脏、肝脏、脾、肾脏、膀胱、前列腺、精囊腺、睾丸和脊柱，最后再剖开四肢取出肱骨和股骨，均置于固定液中。各组织器官经固定后，制成石蜡切片，HE染色后在显微镜下观察。
1.7 统计学处理方法 运用统计软件SPSS12.0，采用非参数检验中的Friedman检验对测量资料进行统计学分析。
2 结果
2.1 肿瘤生长情况 80%（4/5）裸鼠于第8周后在前肢腋窝皮下长出肉眼可见肿瘤,并且肿瘤直径随时间推移逐渐增大。肿瘤质硬，活动度较好，与周围组织分界较清，颜色较深，一般呈灰黑色。至第12周，此4只裸鼠的肿瘤直径分别达到0.3 cm、0.5 cm、1.5 cm、1.7 cm(图1中箭头所示裸鼠皮下肿块直径达到1.7 cm)。
2.2 tPSA含量变化与肿瘤生长 在接种后第2、4、6、8、12周测得的5只裸鼠血浆tPSA 含量由表1列出(第10周未检测)，可见裸鼠的血浆tPSA含量基本上呈现随时间推移而上升，即随着肿瘤生长而上升的趋势(因测量资料中存在不确定值，故采用非参数检验中的Friedman检验，P<0.5) 。
2.3 原位肿瘤组织病理检查结果 在12 w后将裸鼠用乙醚麻醉后处死，解剖观察，发现肿瘤包膜完整，肿瘤附近可见淋巴结肿大，但经病理切片观察，未发现肿大淋巴结中含有肿瘤细胞，而其他相关器官经病理切片证实，也均未发现肿瘤转移。HE染色观察肿瘤组织可见典型前列腺癌细胞，肿瘤细胞呈片状弥漫分布，核大深染，呈圆形，核仁明显，并见核分裂，间质血管丰富(见图2)；还可观察到肿瘤细胞异型性，大小形状不一，核仁明显，周围可见卫星灶(见图2)。
3 讨论
理想的前列腺癌动物模型应能模拟人前列腺癌发生、、结局的生理病理全过程，能体现出人前列腺癌各阶段的特点，能模拟人前列腺癌基因的改变和前列腺癌对的反应，具有便于检测的能反映前列腺癌疾病状态的生物指标，并且可以重复，能标准化，相应疾病进展迅速，以便于研究。到目前为止，要使构建的前列腺癌动物模型能达到上述的所有要求较为困难，但我们可以使模型具备尽可能多的理想特点或者我们可以构建分别具备各种理想特点的一系列模型来模拟前列腺癌进展的各个阶段。
免疫缺陷动物的培育成功，使人们能较容易地构建人肿瘤异种移植模型。与其他类型的异种移植模型相比，皮下移植肿瘤模型具有接种方便，易于在实验过程中观察肿瘤生长情况等优点。而采用不同细胞系构建的各种皮下移植肿瘤模型亦具有不同的特点。LNCaP细胞株能分泌PSA和表达DD3mRNA，并且具有雄激素依赖性的显著特点。这使得采用LNCaP细胞株构建的模型除了能模拟人前列腺癌的一般特性，更能有效地模拟人前列腺癌雄激素依赖阶段以及从雄激素依赖到非依赖转变阶段的一些特性，另外还能在实验过程使人们能够检测到反映前列腺癌进展状况的特异性很强的肿瘤标志物。所以，构建LNCaP皮下移植肿瘤模型对于研究人前列腺癌雄激素依赖阶段以及从雄激素依赖到非依赖转变阶段的一些相关课题具有较大价值。此外，该模型能表达DD3mRNA，这也为进一步研究DD3基因功能提供了有效实验工具。
在本实验中，采用了基底膜基质[3]与LNCaP细胞混合注射的方法，成功建立了裸鼠皮下LNCaP前列腺癌模型，皮下肿瘤模型成功率较高(4/5)，肿瘤形成时间较一致(8 w)，肿瘤在形成、生长过程中能持续稳定地分泌PSA，且其分泌量能随肿瘤生长而上升，体现出此模型可以较好地作为一种前列腺癌的研究工具，可以应用于评价抗肿瘤药物药效等实验中。
此次实验由于在肿瘤形成之后各只裸鼠皮下肿瘤的生长速率不同，以致最终肿瘤大小存在较明显差别，这可能跟裸鼠的个体免疫系统差异有关。在检测tPSA过程中，发现少数几次检测结果比前一时间点的tPSA含量稍微下降，原因可能是在这两个时间点之间，裸鼠皮下肿瘤未有明显增长，故其分泌的PSA量没有明显变化，而检测数据的稍微下降可能是两次检测结果的误差导致。在本实验中，有1只裸鼠始终未长出肉眼可见肿瘤，后经病理切片观察也未发现肿瘤细胞，但却能检测出血浆tPSA，可能是因为其肿瘤细胞较少而未被观察到。另外，本次实验中裸鼠皮下肿瘤均未发现转移，这与Sato等[6]的报道相符。
综上所述，构建LNCaP皮下移植模型操作方便，成模时间较短，成功率高，实验过程易于观察，并且具有雄激素依赖、能稳定有地分泌PSA和表达DD3mRNA的显著特点，是一种非常有实用价值的前列腺癌研究工具。
【】
[1] 王天元,孙颖浩,邱镇,等.人类前列腺癌裸鼠原位移植模型的建立[J].中华泌尿外科杂志,2005,26(3):208-209.
[2] 罗勇,张林琳,贺大林,等.裸鼠前列腺原位肿瘤模型的建立 [J].第四军医大学学报,2005,26(19):1797-1799.
[3] 邓小虹,Sakamoto Hideki, Satoh Kazuo. Matrigel在建立人瘤动物移植模型方面的研究 [J]. 肿瘤,1996,16(2):89-91.
[4] Sato N, Gleave ME, Bruchovsky N, et al. A metastatic and androgen-sensitive human prostate cancer model using intraprostatic inoculation of LNCaP cells in SCID mice [J].Cancer Res, 1997, 57(8):1584-1589.
