新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性规律及其S-100蛋白表达和雪旺细胞增殖研究
【摘要】 目的:了解新生SD大鼠周围神经Wallerian变性不同时间点S-100蛋白表达变化及对雪旺细胞增殖的影响。方法:10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d，进行雪旺细胞培养和S-100免疫组织化学染色观察。结果:在损伤周围神经的近端发生可逆性变性，远端则发生永久性Wallerian变性。实验组雪旺细胞增殖速率与S-100蛋白阳性染色率均优于对照组，7 d组增殖能力达到高峰，S-100蛋白阳性染色率约51%～56%，与对照组比较差异有显著性。结论:新生SD大鼠周围神经受损后变性过程类似于经典的Wallerian变性，且能在变性中期获得活力较强及倍增时间较短的雪旺细胞。
【关键词】 雪旺细胞 Wallerian变性 人工神经 组织工程
Abstract: Objective: To study the S-100 expression change and the effect of reproductive activity on Schwann cells at different time points during Wallerian degeneration of the peripheral nerve of the neonatal SD rats. Methods: The sciatic nerves of the 10-day rats were ligated and pre-degenerated and the experimental result was analyzed with the methods of Schwann cells culture and S-100 protein was post-operatively observed in 24 hours, the 3th day, 5th day, 7th day and 9th day, respectively. Results: The reversible degeneration could take place at the proximal extremity of the damaged peripheral nerve, but the permanent Wallerian degeneration took place at the distal extremity. The reproductive rate of Schwann cells and the positive staining rate in the experimental group were better than that of the control group. The reproductive ability in the 7th day group reached the peak and the positive rate of S-100 protein was about 51%～56% in the 7th day. It had significant difference when compared to the control group. Conclusion: The degenerative process of damaged peripheral nerve of the neonatal SD rats is similar to the process of the typical Wallerian degeneration. The stronger reproductive activity and the shorter doubling time of Schwann cells can be obtained during the middle stage of Wallerian degeneration.
Key words: Schwann cell; Wallerian degeneration; artificial nerve; tissue engineering
周围神经受到卡压、断裂等损伤后，在损伤远端将不可避免发生Wallerian变性，雪旺细胞呈阶段性增殖，为神经轴突再生修复提供神经营养因子。笔者利用这一现象对成年大鼠周围神经作预变性，在其增殖期内取材培养以获取激活态雪旺细胞[1]；另有研究表明，新生动物来源性雪旺细胞比成年动物增殖活性高。
本实验对新生10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，参照成年大鼠经典Wallerian变性，在变性后不同时间点取材，进行雪旺细胞培养及坐骨神经S-100蛋白免疫组织化学染色观察，并与未预变性组对比，观察并分析新生SD大鼠Wallerian变性的规律。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验动物：10 d龄SD大鼠，雌雄不限，体重25～30 g（东南大学医学院实验动物中心提供）。
1.1.2 实验用主要试剂与仪器：CO2培养箱（Heraeus BB5060uv型），倒置显微镜（Nikon TS100型），高速台式离心机（TDL-16G），Ⅱ型胶原酶（Gibaco），DMEM/F12培养液（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青公司生产），50 ml培养瓶（丹麦NUNC公司生产）、胰蛋白酶（Sigma公司生产），多聚赖氨酸（Sigma生产），S-100免疫组化试剂盒（北京中山公司提供）。
1.2 方法
1.2.1 实验动物选取及分组：随机选取10 d龄SD大鼠80只，所有新生大鼠右侧坐骨神经预Wallerian变性作为实验组，左侧不予处理作为自身对照组。由8只母鼠喂养。分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d随机选取16只进行实验，其中8只进行雪旺细胞培养，余下作免疫组织化学染色观察。
1.2.2 新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性：所有新生SD大鼠术前均禁饮8 h，经0.2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉后，在无菌条件下作右股后正中切口显露股二头肌和臀后血管束，游离右侧坐骨神经，在梨状肌下缘3 mm处用5-0丝线结扎坐骨神经，留2 mm线头标记，分层缝合切口；左侧坐骨神经不予处理。术后仍由母鼠喂养。术后未有新生鼠死亡，排除对照组切口感染1只，余79只纳入检测、统计。
1.2.3 雪旺细胞培养：随机选取术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组新生SD大鼠各8只，经引颈处死后，浸入0.3%碘伏5 min，切取40只鼠右侧结扎线远侧端1.2 cm长的坐骨神经和左侧同等长度坐骨神经，并将实验组与对照组所有坐骨神经集中培养。按双酶消化培养法获得原代雪旺细胞，将雪旺细胞稀释成（2.5～3.0）×105/ml，接种1.5 ml于50 ml培养瓶，置于37 ℃、含5% CO2温箱培养24 h后，用含10-5mol/L的Ara-C的DMEM/F12混合培养液作用24 h，后改为正常DMEM/F12血清培养液培养。5 d后，待细胞长满培养瓶时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，每周更换培养液2次。
1.2.4 绘制雪旺细胞的生长曲线：当24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组及对照组传2代后的雪旺细胞长满培养瓶底时，在每天同一时间点，吸出培养基，勿弃之，用PBS溶液冲洗2次，勿剧烈震荡。然后加入0.25%胰蛋白酶消化并于显微镜下观察，待贴壁的细胞收缩、变圆后，但尚未脱落时移去消化液，把原培养液倒回，用毛细吸管充分反复吹打制成细胞悬液，镜下观察，所有细胞从培养板壁脱落，取细胞悬液于细胞计数板上每ml的细胞数，绘制雪旺细胞生长曲线,并统计术后不同时间点的所有观察天数雪旺细胞总数。
1.2.5 S-100免疫组化染色观察：与取材作雪旺细胞培养的同时，各组动物经引颈处死后，将术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组余下的新生SD大鼠实验侧及对照侧坐骨神经同时取出，置入10%甲醛溶液中，经过常规石蜡切片过程，制成结扎线远侧1 cm坐骨神经的纵切片和横切片，然后采用北京中山公司提供的美国ZYMED公司生产的SP-9003试剂盒对组织切片进行免疫组织化学染色。用同济医科大学HPIAS-1000 病理图像分析系统在400倍镜下每例取3个视野进行自动盲测，计数每视野阳性雪旺细胞数。
1.3 统计学处理方法 所有试验结果均重复3次以上，计量资料以±s表示，所有的数据用统计软件SPSS13.0进行统计学分析，不同时间点的实验组与对照组之间采用t检验，实验组的不同时间组间采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 雪旺细胞观察 经双酶消化法培养及Ara-C作用去除成纤维细胞，并传代2次后，在倒置显微镜下对术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组及对照组进行雪旺细胞观察。结果发现各实验组均比对照组雪旺细胞生长旺盛，增殖速率快于对照组，且细胞倍增时间短于对照组，尤以7 d组最明显(见图1，图2)。雪旺细胞呈长梭形，胞体狭窄，胞核透光，核周边缘有一明亮光晕，并伸出约45μm的细长突起，状如麦芒，为单极和双极，少见三极，突起长度可达胞体横径5～10倍，继续培养后，雪旺细胞的突起继续增长，并按略呈“圆形”的规则形状不断生长、分裂和繁殖，细胞突起首尾相互融合、交联，瓶壁上有少许生长不佳的成纤维细胞。每视野雪旺细胞的阳性率约为95%。x
【摘要】 目的:了解新生SD大鼠周围神经Wallerian变性不同时间点S-100蛋白表达变化及对雪旺细胞增殖的影响。方法:10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d，进行雪旺细胞培养和S-100免疫组织化学染色观察。结果:在损伤周围神经的近端发生可逆性变性，远端则发生永久性Wallerian变性。实验组雪旺细胞增殖速率与S-100蛋白阳性染色率均优于对照组，7 d组增殖能力达到高峰，S-100蛋白阳性染色率约51%～56%，与对照组比较差异有显著性。结论:新生SD大鼠周围神经受损后变性过程类似于经典的Wallerian变性，且能在变性中期获得活力较强及倍增时间较短的雪旺细胞。
【关键词】 雪旺细胞 Wallerian变性 人工神经 组织工程
Research on the rule of the Wallerian degeneration of the sciatic nerve in the neonatal SD rats, its S-100 protein expression and the proliferation of Schwann cells CHU Ting-gang*, GAO Wei-yang, HUANG Jing-long, et al. *Department of Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325027
Abstract: Objective: To study the S-100 expression change and the effect of reproductive activity on Schwann cells at different time points during Wallerian degeneration of the peripheral nerve of the neonatal SD rats. Methods: The sciatic nerves of the 10-day rats were ligated and pre-degenerated and the experimental result was analyzed with the methods of Schwann cells culture and S-100 protein was post-operatively observed in 24 hours, the 3th day, 5th day, 7th day and 9th day, respectively. Results: The reversible degeneration could take place at the proximal extremity of the damaged peripheral nerve, but the permanent Wallerian degeneration took place at the distal extremity. The reproductive rate of Schwann cells and the positive staining rate in the experimental group were better than that of the control group. The reproductive ability in the 7th day group reached the peak and the positive rate of S-100 protein was about 51%～56% in the 7th day. It had significant difference when compared to the control group. Conclusion: The degenerative process of damaged peripheral nerve of the neonatal SD rats is similar to the process of the typical Wallerian degeneration. The stronger reproductive activity and the shorter doubling time of Schwann cells can be obtained during the middle stage of Wallerian degeneration.
Key words: Schwann cell; Wallerian degeneration; artificial nerve; tissue engineering
周围神经受到卡压、断裂等损伤后，在损伤远端将不可避免发生Wallerian变性，雪旺细胞呈阶段性增殖，为神经轴突再生修复提供神经营养因子。笔者利用这一现象对成年大鼠周围神经作预变性，在其增殖期内取材培养以获取激活态雪旺细胞[1]；另有研究表明，新生动物来源性雪旺细胞比成年动物增殖活性高。
本实验对新生10 d龄SD大鼠坐骨神经进行结扎预变性，参照成年大鼠经典Wallerian变性，在变性后不同时间点取材，进行雪旺细胞培养及坐骨神经S-100蛋白免疫组织化学染色观察，并与未预变性组对比，观察并分析新生SD大鼠Wallerian变性的规律。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验动物：10 d龄SD大鼠，雌雄不限，体重25～30 g（东南大学医学院实验动物中心提供）。
1.1.2 实验用主要试剂与仪器：CO2培养箱（Heraeus BB5060uv型），倒置显微镜（Nikon TS100型），高速台式离心机（TDL-16G），Ⅱ型胶原酶（Gibaco），DMEM/F12培养液（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青公司生产），50 ml培养瓶（丹麦NUNC公司生产）、胰蛋白酶（Sigma公司生产），多聚赖氨酸（Sigma生产），S-100免疫组化试剂盒（北京中山公司提供）。
1.2 方法
1.2.1 实验动物选取及分组：随机选取10 d龄SD大鼠80只，所有新生大鼠右侧坐骨神经预Wallerian变性作为实验组，左侧不予处理作为自身对照组。由8只母鼠喂养。分别于术后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d随机选取16只进行实验，其中8只进行雪旺细胞培养，余下作免疫组织化学染色观察。
1.2.2 新生SD大鼠坐骨神经Wallerian变性：所有新生SD大鼠术前均禁饮8 h，经0.2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉后，在无菌条件下作右股后正中切口显露股二头肌和臀后血管束，游离右侧坐骨神经，在梨状肌下缘3 mm处用5-0丝线结扎坐骨神经，留2 mm线头标记，分层缝合切口；左侧坐骨神经不予处理。术后仍由母鼠喂养。术后未有新生鼠死亡，排除对照组切口感染1只，余79只纳入检测、统计。
1.2.3 雪旺细胞培养：随机选取术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组新生SD大鼠各8只，经引颈处死后，浸入0.3%碘伏5 min，切取40只鼠右侧结扎线远侧端1.2 cm长的坐骨神经和左侧同等长度坐骨神经，并将实验组与对照组所有坐骨神经集中培养。按双酶消化培养法获得原代雪旺细胞，将雪旺细胞稀释成（2.5～3.0）×105/ml，接种1.5 ml于50 ml培养瓶，置于37 ℃、含5% CO2温箱培养24 h后，用含10-5mol/L的Ara-C的DMEM/F12混合培养液作用24 h，后改为正常DMEM/F12血清培养液培养。5 d后，待细胞长满培养瓶时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，每周更换培养液2次。
1.2.4 绘制雪旺细胞的生长曲线：当24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组及对照组传2代后的雪旺细胞长满培养瓶底时，在每天同一时间点，吸出培养基，勿弃之，用PBS溶液冲洗2次，勿剧烈震荡。然后加入0.25%胰蛋白酶消化并于显微镜下观察，待贴壁的细胞收缩、变圆后，但尚未脱落时移去消化液，把原培养液倒回，用毛细吸管充分反复吹打制成细胞悬液，镜下观察，所有细胞从培养板壁脱落，取细胞悬液于细胞计数板上每ml的细胞数，绘制雪旺细胞生长曲线,并统计术后不同时间点的所有观察天数雪旺细胞总数。
1.2.5 S-100免疫组化染色观察：与取材作雪旺细胞培养的同时，各组动物经引颈处死后，将术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组余下的新生SD大鼠实验侧及对照侧坐骨神经同时取出，置入10%甲醛溶液中，经过常规石蜡切片过程，制成结扎线远侧1 cm坐骨神经的纵切片和横切片，然后采用北京中山公司提供的美国ZYMED公司生产的SP-9003试剂盒对组织切片进行免疫组织化学染色。用同济医科大学HPIAS-1000 病理图像分析系统在400倍镜下每例取3个视野进行自动盲测，计数每视野阳性雪旺细胞数。
1.3 统计学处理方法 所有试验结果均重复3次以上，计量资料以±s表示，所有的数据用统计软件SPSS13.0进行统计学分析，不同时间点的实验组与对照组之间采用t检验，实验组的不同时间组间采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 雪旺细胞观察 经双酶消化法培养及Ara-C作用去除成纤维细胞，并传代2次后，在倒置显微镜下对术后24 h组、3 d组、5 d组、7 d组和9 d组及对照组进行雪旺细胞观察。结果发现各实验组均比对照组雪旺细胞生长旺盛，增殖速率快于对照组，且细胞倍增时间短于对照组，尤以7 d组最明显(见图1，图2)。雪旺细胞呈长梭形，胞体狭窄，胞核透光，核周边缘有一明亮光晕，并伸出约45μm的细长突起，状如麦芒，为单极和双极，少见三极，突起长度可达胞体横径5～10倍，继续培养后，雪旺细胞的突起继续增长，并按略呈“圆形”的规则形状不断生长、分裂和繁殖，细胞突起首尾相互融合、交联，瓶壁上有少许生长不佳的成纤维细胞。每视野雪旺细胞的阳性率约为95%。
2.2 雪旺细胞计数及生长曲线 通过胰酶消化法，显微镜下雪旺细胞计数可发现各组单位体积培养基内的雪旺细胞数量随着培养时间的延长而增加，呈时间依赖性。培养5 d后，雪旺细胞的增殖速度明显加快，7 d组尤明显(见表1)，与成年SD大鼠Wallerian变性激活态雪旺细胞的时间相符，说明雪旺细胞经过消化、传代而致的生长环境的改变后，需要一定的调整休眠期，才能恢复到正常的生长状态（见图3）。术后各不同时间点的所有观察天数雪旺细胞总数见表1，术后24 h的实验组与对照组的雪旺细胞数在统计学上差异无显著性，术后3 d、5 d、7 d、9 d的实验组与对照组比较，雪旺细胞数均显著增加（P＜0.05）；实验组中术后不同时间点的雪旺细胞数比较发现，各时间点雪旺细胞数在统计学上差异存在显著性（P＜0.05），尤以术后7 d组的雪旺细胞数较多。
2.3 免疫组织化学切片染色观察 Wallerian变性引发系列改变主要集中在损伤远侧，而近侧只发生可逆性改变，所以只比较观察结扎线远端的组织切片，对近端未作比较。
各对照组光镜下观察发现，横切片中神经纤维都呈整齐而紧密地分布，轴突位于中央。髓鞘因染片过程中脱脂而呈网状。髓鞘内外轴膜染成褐色，外轴膜浓染，外轴膜外有许多不均质浓染斑点，髓鞘无明显着色，雪旺细胞核在龙胆紫复染时成蓝色；纵切片中，神经纤维略呈波浪状，郎飞氏节规则地间断分布，且两个郎飞氏节之间的一个雪旺细胞染成均匀的褐色，包绕着的轴索，其中有一个染成蓝色的细胞核。各对照组S-100蛋白阳性率约为28%～31%（见图4）。
各实验组坐骨神经损伤近、远端神经纤维部分均肿胀，肿胀程度随着观察时间延长而加重，但各组远端神经变性的程度均比近端重，表现为结扎远端附近轴索、髓鞘部分已崩解成无任何结构的碎片，碎片中出现部分浓染的碎片，且增殖的雪旺细胞体积增大、浓染，新生的雪旺细胞首尾相连，形成类似Büngner带。新生雪旺细胞的S-100蛋白阳性染色率逐渐升高，至7 d组达到峰值，约51%～56%，9 d组则下降（见图5）。
3 讨论
成年动物周围神经在受到损伤时，神经远端即会发生经典Wallerian变性，近端出现可逆性变化，轴突发出轴芽向前滑行长到远端的Büngner带中，雪旺细胞使新生轴突髓鞘化，继而完成神经再生过程。Wallerian变性的一个重要的启动因子就是成熟的髓鞘蛋白的降解，有研究表明：成年鼠坐骨神经受损伤产生应答明显快于3 d龄以下的幼鼠。Keilhoff G等[3]通过实验又证实经过Wallerian变性的成年动物周围神经在其预变性后的最初一段时间内，雪旺细胞的增殖和活力都增强。有研究表明，低于3 d的SD大鼠不能形成成熟的髓鞘，故3 d龄以下的SD大鼠周围神经受损伤时，没有经典的Wallerian变性过程，各个时期的雪旺细胞活力并未增加，这就是我们采用10 d龄SD大鼠的原因。
S-100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族，主要分布于中枢神经系统和周围神经系统的星型胶质细胞、雪旺细胞、某些神经元细胞、黑色素瘤细胞、软骨细胞和皮肤朗格汉斯细胞等[4]。但在周围神经系统，并非所有雪旺细胞在任何时候都表达S-100蛋白，只有形成髓鞘与不形成髓鞘的成熟雪旺细胞在活力增强状态下才强烈表达S-100蛋白[5]。实验结果发现10 d龄SD大鼠坐骨神经变性过程中，变性近端S-100阳性染色率随着新生轴突生长而经历了一个由应激剧增、耗竭性低表达、形成Büngner带时至峰值，再渐恢复至正常的过程，而变性远端则伴随变性逐渐降低至最终消失，伴随着S-100蛋白表达变化的同时，无论雪旺细胞的总数量，还是雪旺细胞的倍增时间及增殖活力都比未变性时有明显提高，但在第7天时S-100蛋白表达与雪旺细胞的增殖数量都同时达到高峰，这一过程与周围神经损伤后的生理修复过程相吻合。但在变性远端，我们与Antonio观察到的现象相同[6]，S-100蛋白的表达并未同雪旺细胞的增殖一致，反下降至消失，变性初期形成的Büngner带是由大量的类纤维细胞和未活化雪旺细胞构成，同时S-100蛋白是雪旺细胞成熟的一个标志，所以此时雪旺细胞未有S-100蛋白表达[7]。Reichert等[8]发现周围微环境的变化将会影响吞噬Wallerian变性产物吞噬细胞的种类，体内变性时吞噬细胞为巨噬细胞和雪旺细胞，体外则为雪旺细胞，可以推断雪旺细胞可能在变性初期除了能分泌神经营养因子外，还具有吞噬细胞的功能，参与对髓鞘变性产物的主动清除，从而有利神经的再生，且有研究发现雪旺细胞的吞噬功能较弱, 吞噬主要由巨噬细胞完成[9]。
本实验将所有组次10 d龄SD大鼠实验组及对照组的坐骨神经一起作雪旺细胞原代培养，不仅是为了减少工作量，主要是笔者预实验时曾作单只10 d龄SD大鼠坐骨神经实验组及对照组的单独培养，发现由于单只单侧坐骨神经取材量太少，大部分雪旺细胞生长结果都是不理想，无足够的细胞数量来进行下一步的实验，故采用每组次共同培养，取材于新生SD大鼠的雪旺细胞，同种异体间排异不明显，且本试验也并未发现短期内明显的排斥现象。
通过对10 d龄SD大鼠坐骨神经进行预变性，在不同时间点取材作坐骨神经S-100免疫组化染色及雪旺细胞培养，观察变性远端不同时期S-100蛋白表达变化，发现10 d龄SD大鼠坐骨神经变性过程符合经典Wallerian变性的特征，且在Wallerian变性的第7天能获取新生SD鼠激活态的雪旺细胞，可为周围人工神经培养所需的雪旺细胞取材提供一点思路。
【】
[1] 劳杰, 顾玉东, 熊良俭, 等.预变神经段修复神经缺损的实验研究[J].中华手外科杂志, 1998, 14(2):114-115.
[2]褚庭纲, 黄金龙.脱细胞骨骼肌支架与雪旺细胞构建体外人工神经模型的研究[J].东南大学学报(医学版), 2006, 25(1): 12-16.
[3]Keilhoff G,Fansa H,Sehneider W,et al.In vivo predegeneration of peripheral nerves:An effect technique to obtain activated Schwann cells for nerves conduits[J].J Neurosci Methods,1999, 89(1):17-24.
[4]Michetti F, Cazzlo D. S100B protein in biological fluids: a tool for perinatal medicine[J]. Clin Chem,2002,48 (12):2097-2104.
[5]Sugimura K,Haimoto H,Nagura H,et al.Immunohistochemi-cal differential distribution of S-100αand S-100β in the peripheral nervous system of the rat[J].Muscle Nerve,1989, 12(11): 929-935.
[6]Antonio Spreca.Immunocytochemical localization of S-100 protein in degenerating and regenerating rat sciatic nerves[J]. J Histochem Cytochem,1989,37(4):441-446.
[7]张殿英, 姜保国, 傅忠国, 等.周围神经损伤后Ｓ-100蛋白的分布和变化研究[J].矫形外科杂志, 2002, 9(4): 348-350.
[8]Reichert F,Saada A,Rotshenker S.Peripheral nerve injury in-duces Schwann cells to express two macrophage phenotypes: phagocytosis and the galactose-specific lectin MAC-2[J].J Neurosci,1994,14 (5 Pt 2):3231-3245.
[9]Liu HM,Yang LH,Yang YJ.Schwann cell properties: 3. c-fos expression, bFGF production, phagocytosis and pro liferationduring Wallerian degeneration[J].J Neuropathol Exp Neurol,1995,54: 487-496.
