慢性低O2高CO2对小鼠神经元凋亡及硝基酪氨酸表达的影响

【摘要】  目的:探讨慢性低O2高CO2对小鼠皮层及海马神经细胞凋亡及硝基酪氨酸表达的影响。方法:雄性C57BL/6小鼠24只，随机分为对照组、低O2高CO2 2 w组和低O2高CO2 4 w组，采用原位末端标记法检测皮层和海马区神经细胞凋亡并凋亡指数（AI），免疫组织化学染色检测皮层和海马区细胞硝基酪氨酸的表达。结果:慢性低O2高CO2 2 w组和4 w组小鼠皮层和海马AI及硝基酪氨酸表达均明显高于对照组，两者呈正相关。结论:慢性低O2高CO2可以诱发小鼠皮层和海马神经元凋亡，可能与其促进硝基酪氨酸表达有关。

【关键词】  低氧 高碳酸血症 小鼠 神经元 凋亡 硝基酪氨酸

    Abstract:  Objective: To explore the effects of chronic hypoxic hypercapnia on the apoptosis of mouse neural cells and the expression of nitrotyrosine in the cortex and hippocampus. Methods: Twenty four male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups: normal control, hypoxic hypercapnia 2 w,hypoxic hypercapnia 4 w. The apoptosis indexes (AI) of neural cells in cortex / hippocampus were achieved by terminal deoxynuleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)and the expression of nitrotyrosine in the cortex / hippocampus was detected by immunohistochemistry. Results: Both the AI and the expression of nitrotyrosine of neural cells in cortex and hippocampus in hypoxia hypercapnia groups were higher than those in normal control group. Correlative analysis showed that there was a positive correlation between AI and the expresson of nitrotyrosine. Conclusion: Chronic hypoxic hypercapnia can induce neural cells apoptosis in mouse cortex and hippocampus,which may be associated with its effects on expression of nitrotyrosine.

    Key words:   hypoxia；chronic；hypercapnia；mouse；neurons；apoptosis；nitrotyrosine

    动物实验发现，慢性缺氧能够引起脑组织结构和功能的损害，可能与多种因素有关,如谷氨酸过量释放、细胞内钙离子超载、自由基产生等。但确切的机制尚未阐明。低氧导致的NO产生和清除之间的平衡破坏，加重自由基对细胞的损害可能是造成神经细胞损伤、凋亡的重要因素[1]。本实验通过建立慢性低氧高二氧化碳小鼠模型，观察不同阶段的神经细胞的凋亡，检测NO/ONOO-代谢产物硝基酪氨酸（Nitrotyrosine，NT）的表达，探讨慢性低氧高二氧化碳诱导神经细胞凋亡的可能机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料  SPF级雄性C57BL/6小鼠由温州医学院实验动物中心提供，TUNEL试剂盒由武汉博士德公司提供，兔抗小鼠硝基酪氨酸抗体由美国Chemicon公司提供，DAB染色试剂盒、抗兔生物素化二抗、HRP标记链亲和素由上海晶美生物工程有限公司提供。

    1.2  方法

    1.2.1  实验分组：SPF级雄性C57BL/6小鼠24只，体重23～27 g，随机分为对照组（C组）、低O2 高CO2 2 w组（2HH组）及低O2高CO2 4 w组（4HH组），每组8只。

    1.2.2  模型建立：将小鼠置于常压低氧高二氧化碳动物饲养舱内[2]，维持舱内氧浓度在9%～11%，二氧化碳浓度为5%～6%，温度为22～26 ℃范围。2HH组在氧舱内2 w，4HH组在氧舱内4 w，每天8 h，每周6 d。为了使动物能适应，每次氧浓度从21%降至10%的时间控制在15～20 min，二氧化碳浓度升高至5%的时间控制在30 min。对照组小鼠吸入空气，其他条件与模型组相同。动物饲养到各相应时间点后，颈椎脱臼法处死取右侧皮层和海马，固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

    1.2.3  检测指标：采用原位末端标记法检测皮层和海马区细胞凋亡并计算凋亡指数（AI），免疫组织化学染色检测皮层和海马区细胞NT表达，均严格按照试剂盒说明书进行操作。每张切片随机在高倍镜下摄影3张，利用Image-Pro Plus 6.0生物图像处理系统处理检测累积光密度(integrated optical density，IOD)取平均值，作为NT相对含量。

    1.3  统计学处理方法  多个样本间计量资料的比较用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett'T3检验。两变量的相关分析用直线相关分析法。

    2  结果

    2.1  皮层和海马区神经细胞凋亡指数  C组偶见皮层细胞和海马细胞凋亡；低O2高CO2两组细胞凋亡较C组明显增加(均P<0.01)。随着暴露于低O2 高CO2时间的延长，细胞凋亡增多：4HH组皮层细胞凋亡较2HH组高51%（P<0.01）；海马细胞凋亡较2HH组高133%（P<0.01）（见表1）。

    2.2  皮层神经细胞NT的表达  NT抗原在C组未见表达。2HH组可见散在神经细胞NT表达，为棕黄色，主要位于细胞质，NT阳性神经细胞形态基本正常。4HH组为深棕黄色，部分神经细胞体积缩小，与周围组织之间存在空壳区，NT表达的IOD值是2HH的123%(P<0.05)。见表2、图1。

    2.3  海马区神经细胞NT的表达  C组未见NT阳性表达。2HH组神经细胞可见NT表达，为棕黄色，主要位于细胞质，部分阳性神经细胞体积缩小，4HH组NT表达的IOD值是2HH的147%(P<0.01)。见表2、图2。

    2.4  相关性分析  皮层神经细胞凋亡指数、海马区神经细胞凋亡指数与NT表达的IOD值之间均呈正相关关系(r=0.827和0.880，均P<0.01，n=24)。

    3  讨论

    氧化应激是体内氧自由基的产生与清除之间的平衡失调或外源性氧化剂的过量进入而导致活性氧在体内积聚，引起细胞损害。研究显示，脑缺氧时，兴奋性氨基酸——谷氨酸过度积累，使NMDA受体依赖的钙通道激活，并使电压依赖性镁离子NMDA受体通道的阻断减弱，Ca2+内流与钙调蛋白（calmodulin，CaM）结合，激活受Ca2+-CaM调节的nNOS，合成过量的NO[3]。NO是半衰期极短的自由基气体分子，对中枢神经系统的作用具有双重性：一方面，生理状态下NO作为神经递质及信使分子参与神经细胞的信息传递，激活鸟苷酸环化酶使cGMP水平升高，扩张脑血管以增加脑血流供给，对神经细胞有保护作用；另一方面，在一定病理条件下，过量的NO合成会产生神经毒性作用。

    NO可能通过多种途径参与神经损伤作用：①线粒体损伤：NO参与抑制线粒体呼吸链功能[4]，导致线粒体内膜脂质过氧化，加速Ca2+内流，MPT开放增多，以及促凋亡蛋白如细胞色素C增多，诱导细胞凋亡[5]。②氧化应激：NO极易与O2-·发生自由基链式反应，加重对细胞的损伤，如NO和O2-·可快速结合生成ONOO-。体外实验表明，ONOO-可导致纯化的DNA解链[6]、膜脂质过氧化[7]、许多重要酶类的灭活[8]；同时ONOO-可使蛋白质中酪氨酸残基的邻位发生硝基修饰，生成硝基酪氨酸。这是ONOO-在体内生成的特异性代谢产物[9]。经硝基化的蛋白生物活性会发生改变，如线粒体的MnSOD、细胞色素C、电压依赖性阴离子通道、ATP酶及CoA等硝基化后，抑制呼吸链的传递及ATP产生不足，导致细胞内能量耗竭[10]，从而产生细胞损伤、凋亡甚至坏死。

    本研究结果显示，低O2高CO2能诱导小鼠皮层、海马神经元凋亡，这种作用随着暴露于低O2高CO2  时间延长而趋明显，同时，硝基酪氨酸含量增加，并且，两者之间有着密切联系。我们推测，硝基酪氨酸含量的增加与神经元的凋亡有关。如上所述，这种作用同NO作用有关，其中硝基酪氨酸对蛋白质的功能影响起着重要作用。

【】
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