实验性2型糖尿病大鼠睾丸Leydig细胞形态和睾酮合成功能的改变

【摘要】  目的:研究糖尿病时睾丸的组织病变化及睾丸间质细胞(Leydig细胞)睾酮合成功能的改变。方法：雄性成年SD大鼠20只，随机分为正常对照组10只、糖尿病组10只。后一组给以高脂饮食加小剂量（25 mg/kg）链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病大鼠模型，12周后处死。用光镜及电镜观察大鼠睾丸的组织形态学改变；逆转录-PCR法检测睾丸组织类固醇激素合成灵敏调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory proteins，StAR）、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)及17a-羟基化酶/17，20-裂解酶 (P450c17) mRNA含量；酶联免疫吸附法测定血清中睾酮和黄体生成素（leutelnizing hormone，LH）含量。结果：糖尿病大鼠光镜下主要表现为Leydig细胞数量减少，体积变小；透射电镜下主要见到Leydig细胞萎缩；睾丸组织的StAR mRNA和P450scc mRNA含量糖尿病组低于正常对照组(P<0.05)， P450c17含量糖尿病组较正常对照组差异无显著性(P>0.05)；与正常对照组相比血清中睾酮和LH含量降低(P<0.05)。结论：成年期2型糖尿病可以引起大鼠睾丸Leydig细胞功能降低, 形态结构改变。

【关键词】  糖尿病 2型 间质细胞 睾酮 黄体生成素 RT-PCR

    Abstract:  Objective: To study the pathological changes of testis and the changes of the synthesis funelion of testosterone of Leydig cells in type 2 diabetic rats. Methods: Twenty male Sprague-Dauley rats were divided into two groups randomly: normal control group and type 2 diabetic group. Morphological changes of the Leydig cells in both groups were observed under the light microscope (LM) and transmission electron microscopy (TEM). Concentration of blood luteinizing hormone (LH) and testosterone (T) were assayed with the technique of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Expression of steroidogenic acute regulatory protein (StAR) mRNA， cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) mRNA， and cytochrome P450 17a-hydroxylase (P450c17) mRNA from Leydig cells were examined with RT-PCR respectively. Results:Compared to normal group，the number of Leydig cells decreased under LM and the volume of Leydig cells shrinked under TEM. The level of blood LH and T decreased，the mRNA expression of StAR，P450scc decreased， and the expression of P450c17 mRNA appeared descendent tendency but had no significance in type 2 diabetic group. Conclusion: Type 2 diabetes mellitus impairs T synthesis and the construction of Leydig cells.

    Key words:  diabetes mellitus，typez；Leydig cells；testosterone；luteinizing hormone；RT-PCR

    糖尿病是一种较常见的内分泌代谢障碍性疾病，其慢性并发症可影响全身重要器官，随着糖尿病发病率的逐年上升及出现的年轻化趋势，糖尿病并发的生殖损伤引起人们极大的关注。研究证明:糖尿病大鼠性功能障碍的直接原因与持续高血糖引起的细胞代谢异常、氧化应激有关，其发病可能是通过自主神经功能障碍、糖尿病微血管病变、下丘脑对垂体-性腺轴调控障碍得以实现［1，2］。本实验以下丘脑-垂体-睾丸轴为中心，通过光镜和电镜观察糖尿病大鼠睾丸Leydig细胞的病理改变，测定睾丸组织中LHR、P450scc、P450c17及StAR mRNA含量及血清中睾酮及LH含量，来阐述糖尿病状态下它们之间的变化关系。

    1  材料和方法

    1.1  动物分组及处理  由温州医学院实验动物中心提供的雄性健康60日龄SD大鼠20只，体重180～220 g，随机分为：①糖尿病组10只，给以高糖高脂饲料（饲料组成：10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料）1个月后，按25 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）(Sigma公司产品，溶于0.1 mmol/L枸椽酸缓冲液内，pH 4.0)。注射前禁食12 h，注射后72 h测空腹血糖≥8.0 mmol/ L为模型成功。本实验动物数不含被淘汰者。②正常对照组10只，喂以普通饲料，腹腔内注射等容积枸椽酸缓冲液。此后，糖尿病组继续给以高糖高脂饮食，正常对照组给以普通饮食，12周后处死。

    1.2  血清睾酮测定  股动脉放血处死大鼠，各取血3 ml，2 000 r/ min，15 min，吸取上清液置－30 ℃冰箱保存，用酶联免疫吸附法测定睾酮含量。

    1.3  光镜标本的制备  剪开阴囊，暴露睾丸，每只大鼠左睾丸白膜下用2.5%戊二醛原位固定0.5 h后，横切面剖开睾丸切成3 mm薄片，置于10%中性福尔马林液中固定，经常规乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制作切片，厚3μm，HE染色，中性树胶封固。

    1.4  电镜标本的制备  将上述白膜下原位固定0.5 h后的睾丸切成1 mm ×1 mm ×1 mm 小块，迅速置2.5%戊二醛4 ℃固定l h，锇酸后固定，常规PBS漂洗、丙酮梯度脱水，Epon812 包埋,LKB-V型超薄切片机切片，铅铀双重染色，H-600A型透射电镜下观察。

    1.5  RT-PCR  取右侧睾丸新鲜组织100 mg加1 ml Triol（美国Invitrogen公司提供），提取各组大鼠睾丸组织的总RNA。取2μg总RNA，用Promega 逆转录试剂盒合成cDNA。取1μl cDNA为模板，在Taq DNA 聚合酶（ProbeGene公司提供）催化下应用特异性引物行PCR扩增。引物设计参造Gene Bank中LHR、P450scc、P450c17及StAR mRNA、RPS16 mRNA（作为内参照）序列，由上海宝生物公司合成。所有PCR反应条件均标准化使PCR产物位于线形扩增区。PCR引物及反应条件见表1。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5μg/ml Goldview），Gel-pro凝胶分析系统进行分析，以目的基因和内参照RPS16吸光度的比值来表示相对含量。

    1.6  统计学处理方法  采用成组t检验。

    2  结果

    2.1  光镜观察  与对照组作对比观察发现,糖尿病组大鼠曲细精管萎缩变形或扭曲成不规则形（见图1），管壁上生精细胞数量明显少于对照组，管腔内精子极少甚至无法寻及，个别曲细精管仅见紧靠基膜的支持细胞及精原细胞，而其余各级生精细胞及精子消失，表现为生精阻滞，曲细精管内生精细胞部分或全部脱落，阻塞于管腔内，或生精细胞排列紊乱。上述病变在糖尿病组睾丸内呈多灶性分布，严重时呈弥漫性分布。正常大鼠Leydig细胞在曲细精管间呈簇状分布，多呈棱形或三角形，细胞大，胞浆丰富，细胞核呈圆形或卵圆形，核内染色质呈均匀分布。糖尿病大鼠Leydig细胞仍呈簇状分布于间质区，细胞数目无明显减少，细胞多呈圆形或卵圆形且较正常组缩小，胞浆减少，细胞核皱缩，染色质浓集，深染。

    2.2  电镜观察  正常大鼠Leydig细胞呈棱形，胞质内有丰富的滑面和粗面内质网、高尔基复合体及含有丰富嵴的线粒体，可见少量脂滴；细胞核呈圆形，染色质均匀分布于核周边，可见核仁。糖尿病大鼠Leydig细胞多呈圆形，体积缩小，胞质内线粒体扩张呈圆形或C 形，结构模糊不清，嵴消失；内质网扩张，形状不规则；细胞核缩小，呈圆形，核膜增厚，染色质呈块状聚集，核仁不清。

    2.3  血清睾酮测定  糖尿病组血清睾酮水平明显低于对照组，见表2。

    2.4  P450scc、P450c17 及StAR mRNA的表达 

    睾丸组织的P450scc及StAR mRNA含量糖尿病组低于正常对照组。P450c17含量两组间差异无显著性。见表3。

    3  讨论

    雄性生殖内分泌细胞是睾丸Leydig细胞。Leydig细胞是唯一重要的男性激素来源，它产生睾丸激素——睾酮。研究已证实，睾丸Leydig细胞分泌睾酮的活动受下丘脑-垂体的调控，且LH诱导是Leydig细胞合成睾酮的必要条件［1-4］。下丘脑调节腺垂体LH的分泌，LH与Leydig细胞膜上特异受体LHR结合，动员胆固醇进入线粒体内膜，完成Leydig细胞合成、分泌睾酮的一系列过程［1-５］。研究表明，糖尿病大鼠血浆睾酮、LH、FSH、泌乳素和睾丸间质睾酮明显降低，即高血糖损伤了下丘脑-垂体-睾丸轴，引起相关激素分泌减少，进而导致生精障碍［6］、性与生殖能力障碍[7]，睾丸Leydig细胞产生睾酮能力及支持细胞(Sertoli细胞)分泌雄激素受体结合蛋白(ABP)的能力下降［8］。本实验中发现糖尿病组大鼠血LH、睾酮水平明显低于正常组大鼠，这与以往研究结果相符。生理情况下，睾酮水平降低可以反馈性地使促性腺激素分泌增加［9］，而在糖尿病大鼠未见到促性腺激素升高，提示LH和FSH的减低可能系糖尿病对垂体及其以上水平直接影响的结果，提示糖尿病对垂体-睾丸轴功能有损伤作用。我们认为其机制可能为：糖尿病时，糖基化终末产物大量形成，其通过增加体内氧自由基［10］、脂质过氧化增强及氧自由基清除能力下降［6］，对垂体-睾丸轴造成了直接的损伤，因此，当体内睾酮水平下降时并未反馈性地引起LH的分泌增加，使睾酮恢复到正常水平。

    我们对睾丸Leydig细胞的形态学观察结果更直观地证实了糖尿病可破坏Leydig细胞的结构和功能。糖尿病大鼠睾丸Leydig细胞有线粒体肿胀、变形、排列紊乱、嵴断裂、结构不清，滑面内质网减少及扩张，Leydig细胞数量减少，胞浆脂滴增多等现象，提示Leydig细胞内合成睾酮的能力及某些蛋白合成表达过程中信息传递可能受损。位于Leydig细胞线粒体内膜上的P450scc催化胆固醇生成孕烯醇酮，该反应是睾酮生成的第一步，也是限速步骤[11]；位于线粒体外膜的StAR是类固醇激素合成的关键调节因子，它将胆固醇从细胞质转运到位于线粒体内膜的P450scc上［2］，孕烯醇酮合成后自由扩散到内质网转化成孕酮，孕酮进一步被17a-羟基化酶/17，20-裂解酶(P450c17)催化裂解成雄烯二酮，雄烯二酮进一步还原成睾酮。本实验结果显示：糖尿病组大鼠Leydig细胞StAR、P450scc mRNA表达低于正常组大鼠(P <0.05)，与形态学观察结果相符；P450c17与正常组比较，差异无显著性，这可能与下列因素有关。①StAR蛋白动员转运胆固醇进入线粒体，是在P450scc和P450c17等各种酶的上游发挥作用［12］。②有研究证实，与StAR蛋白相比，对P450scc 和P450c17等各种酶的影响则处于次要地位［13］。因此，是否由于刺激不足而没有引起P450c17产生显著性降低，还需要进一步证明。而P450scc直接依赖于LH分泌的调控，属于营养性激素慢性长期刺激的结果［14］，本实验中糖尿病大鼠Leydig细胞P450scc mRNA水平显著降低，这一现象符合长期慢性调控类固醇激素的合成多表现为睾酮合成酶(尤其是P450scc)mRNA和蛋白的表达降低的观点。

【】
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