葛根素对低O2高CO2肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞线粒体途径凋亡的影响
【摘要】 目的: 研究在慢性低O2高CO2情况下，葛根素对肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)线粒体途径凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组(N组)、慢性低O2高CO2 2周组(H2w组)、慢性低O2高CO2 4周组(H4w组)、慢性低O2高CO2 4周＋葛根素组(H4w+G组)，每组10只。TUNEL法检测PASMCs凋亡；免疫组化测定PASMCs线粒体细胞色素C（Cyt-c）释放量及胞浆Bcl-2、Bax含量；分光光度法检测肺组织匀浆caspase 9酶活性。结果:①H2w组、H4w组和H4w+G组mPAP、RV/(LV+S)、PAMT、PASMCs胞浆 Bcl-2含量均显著高于N组（P <0.01），Cyt-c释放量、Bax含量及肺组织匀浆caspase 9酶活性均显著低于N组（P <0.01）；H2w组、H4w组各级PASMCs和H4w+G组肺弹力型动脉和肺微细动脉PASMCs凋亡指数显著低于N组（P <0.01）。②H4w+G组mPAP、RV/(LV+S)、PAMT、肺弹力型动脉和肺微细动脉PASMCs 中Bcl-2含量均显著低于H4w组（P <0.01）；弹力型动脉和肌型动脉PASMCs凋亡指数、Cyt-c释放量，肺组织匀浆caspase 9酶活性均显著高于H4w组（P <0.01）；Bax含量在H4w+G组与H4w组间差异无显著性（P >0.05）。结论:葛根素有抑制慢性低O2高CO2肺动脉高压和肺血管重建的作用，促进PASMCs通过线粒体途径凋亡可能是其作用机制之一。
【关键词】 低氧 慢性 高血压 肺性 线粒体 凋
Abstract: Objective: To study the effects of puerarin on mitochondrial-dependent apoptosis pathway in pulomnary hypertension induced by hypoxic hypercapnia. Methods: Fourty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: normal control group(N)，hypoxic hypercapnic 2 weeks group (H2w)，hypoxic hypercapnic 4 weeks group (H4w) and hypoxic hypercapnic 4 weeks + Puerarin group (H4w+G). The apoptsis of PASMCs was tested with TUNEL. The release of Cyt-c from mitochondria and the content of Bcl-2 and Bax in cytoplasm were determined with immunohistochemistry. The activity of caspase 9 was detected with spectropho-tometric method. Results: ①The mPAP, RV/(LV+S), PAMT and the content of Bcl-2 of PASMCs of group H2w， group H4w and group H4w+G were significantly higher than those of group N (P <0.01). The release of Cyt-c，the content of Bax of PASMCs and the activity of caspase 9 of lung in group H2w, group H4w and group H4w+G were significantly lower than those in group N （P <0.01）. The apoptotic index of PASMCs in group H2w，group H4w and pulmonary elastic artery and pulmonary arteroles of group H4w+G were significantly lower than those in group N（P <0.01）. ②The mPAP，RV/(LV+S)，PAMT and the content of Bcl-2 in pulmonary elastic artery and arteroles of group H4w+G were significantly lower than those of group H4w (P <0.01). The release of Cyt-c， the apoptotic index of PASMCs in pulmonary elastic artery and pulmonary muscular artery and the activity of caspase 9 of lung in group H4w+G were significantly higher than those in group H4w （P <0.01）.Difference of content of Bax between group H4w+G and group H4w was not significant (P >0.05). Conclusion: Puerarin can lower pulmonary hypertension and inhibit structural remodeling of pulmonary arteries. Facilitating mitochondrial-dependent apoptosis of PASMCs may be one of the mechanisms of this action.
Key words: hypoxia，chronic；hypertension，pulmonary；mitochondria；apoptosis；Puerarin
低氧性肺血管重建中各种类型细胞凋亡减少而增殖增加[1]。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary ar-tery smooth muscle cells，PASMCs)是肺血管壁的主要组成部分，增加PASMCs凋亡可以逆转肺动脉高压肺血管重建[2]。细胞色素C(cytochrome C，Cyt-c) 从线粒体中释放是细胞线粒体途径凋亡的关键步骤[3,4]。线粒体Cyt-c的释放受到Bcl-2蛋白家族的调控，Bcl-2和Bax蛋白是该家族中具有代表性的蛋白，分别起到抑制和促进凋亡的作用[5,6]。葛根素(Puerarin)是豆科植物野葛干燥根中的主要有效成分,大量研究发现，葛根素能促进主动脉平滑肌细胞的凋亡[7]。本实验拟通过研究葛根素对PASMCs线粒体Cyt-c释放、caspase 9活性以及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，探讨葛根素促进PASMCs线粒体途径凋亡是否为其抑制肺动脉高压肺血管重建的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，体重180～210 g，由温州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂：In Situ Cell Death Detection Kit（德国Roche公司产品），Bcl-2、Bax兔抗大鼠多克隆抗体（美国Santa Cruz公司产品），Cyt-c兔抗大鼠多克隆抗体（美国Cell Signaling公司产品），ImmPRESS REAGENT Anti-Rabbit Ig多聚过氧化酶二抗(加拿大Vector Laboratories 公司产品)，caspase 9活性检测试剂盒。Bradford蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所产品）。其余均为市售分析纯。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备：大鼠40只，随机分为对照组(N组)、慢性低O2高CO2 2周组(H2w组)、慢性低O2高CO2 4周组(H4w组)、慢性低O2高CO2 4周＋葛根素组(H4w+G组)，每组10只。H2w组、H4w组置于常压低O2高CO2舱内，充入N2使O2浓度维持在8.5%～11%，CO2浓度维持在5.0%～6.5%。每天8 h，每周6 d，连续2周(H2w组)或4周(H4w组)。H4w+G组每次低O2高CO2前1/2 h腹腔注射葛根素(50 mg/kg体重，郑州羚锐制药有限公司产品，生产批号：0601022)，其条件同H4w组。N组置同室正常氧浓度环境饲养。
1.2.2 大鼠平均肺动脉压力（mPAP）、平均颈动脉压力(mCAP)及右心室重量比(RV/(LV+S)%)、中膜厚度(PAMT)的测定：采用右心导管法[8]测量、mPAP，颈总动脉插管测mCAP。分离右心室（RV）和左心室（LV）+室间隔（S），滤纸吸水分后分别称重，计算两者的比值RV/（LV+S）。 每只大鼠取1张肺组织HE染色切片，每张切片随机选取不同直径(20～200)μm肺动脉各6支，Image-ProPlus 6.0软件测定肺肌型动脉和肺弹力型动脉内中膜厚度(PAMT)。
1.2.3 TUNEL法检测PASMCs凋亡：每只大鼠取1张肺组织石蜡切片，脱蜡水化后蛋白酶K（20μg/mg）37 ℃消化30 min；3% H2O2溶液灭活过氧化酶；加TUNEL restion mixture 50μl/片，37 ℃反应60 min；加 Convert-POD 37 ℃反应30 min；DAB显色；苏木素复染。每张切片选取不同直径肺动脉各2只，使用Image-Pro Plus 6.0计数，凋亡指数（AI）=中膜阳性细胞核数/中膜总细胞核数。
1.2.4 免疫组化法测定PASMCs胞浆线粒体Cyt-c释放、Bcl-2、Bax含量：石蜡切片脱蜡水化；高压修复；3% H2O2溶液灭活过氧化酶；20%马血清室温封闭；加一抗稀释液（Cyt-c多克隆抗体1：25， Bcl-2多克隆抗体1：200，Bax多克隆抗体1：200）37 ℃孵育60 min；多聚过氧化酶二抗室温孵育30 min；DAB显色，苏木素复染。Image-Pro Plus 6.0软件测定肺动脉平滑肌层平均光密度。
1.2.5 分光光度法检测肺组织匀浆caspase 9活性：按照说明书操作，根据设立的标准曲线测定酶活力（1个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37 ℃可以剪切1nmol Ac-LEHD-pNA产生1nmol pNA的caspase 9的酶量）。
1.3 统计学处理方法 多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验。
2 结果
2.1 各组mPAP、mCAP、RV/(LV+S)和PAMT的比较 H2w组、H4w组和H4w+G组的mPAP、RV/(LV+S)、PAMT均显著高于N组（P <0.01），H4w+G组的mPAP、RV/(LV+S)、PAMT均显著低于H4w组(P <0.01)；四组间mCAP差异无显著性（P >0.05）,见表1。
2.2 各组PASMCs的凋亡指数（AI）、线粒体Cyt-c释放量比较 H2w组和H4w组各级肺动脉PASMCs以及H4w+G组肺弹力型动脉、肺微细动脉PASMCs凋亡指数较N组显著下降（P <0.01）；三组各级肺动脉PASMCs Cyt-c释放量显著低于N组（P <0.01）。H4w+G组肺弹力型动脉、肌型动脉PASMCs凋亡指数较H4w组相应直径肺动脉显著升高（P <0.05）；其各级肺动脉PASMCs Cyt-c释放量显著高于H4w组（P <0.01）。见表 2、图 1～4。
2.3 各组PASMCs胞浆Bcl-2、Bax含量比较 H2w组、H4w和H4w+G组大鼠各级PASMCs Bcl-2含量显著高于N组（P <0.01），见图5～7；Bax含量显著低于N组（P <0.01）；H4w+G组肺弹力型动脉和肺微细动脉PASMCs Bcl-2含量显著低于H4w组（P <0.01），见图5～8；Bax含量在两组间差异无显著性（P >0.05）。见表3。
2.4 各组大鼠肺组织匀浆caspase 9酶活性比较 H2w组（49.57±4.52）、H4w组（34.98±4.29）和H4w+G组（55.36±4.65）大鼠肺组织匀浆caspase 9酶活性显著低于N组（84.33±4.47）（P <0.01,F =11.54）；H4w+G组肺组织匀浆caspase 9酶活性显著高于H4w组（P <0.01）。
3 讨论
肺血管重建被认为是慢性低O2高CO2所致肺动脉高压的主要病理变化[9]，主要表现为无平滑肌的肺泡动脉出现肌化，不完整的肌层趋于完整，肺小动脉和微动脉中膜PASMCs肥大和增生，管壁增厚，细胞间质增多，中膜增厚；外膜成纤维细胞增生，合成和分泌细胞外基质增加，并部分转型为肌纤维母细胞，迁移入中膜和内膜。在上述病理过程中，PASMCs凋亡减少[1,10]。本研究通过TUNEL法发现低O2高CO2肺动脉高压大鼠模型各级PASMCs凋亡减少，尤其以肺弹力型动脉和肺微细动脉最为显著，说明凋亡减少导致PASMCs数量增加是血管重构的重要原因。
Cyt-c是一种水溶性蛋白质，由核基因编码。正常情况下Cyt-c定位于线粒体膜间隙，不能通过外膜[3]。细胞凋亡信号引起Cyt-c通过线粒体PT孔（permeability transition pore）或Bcl-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中[15]，与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosis protease ac-tivating factor 1，Apaf-1) 结合形成多聚体，继而与caspase 9结合形成凋亡体(apoptosome)，激活caspase 9 及其下游的caspase,从而诱导细胞凋亡[4]。根据Alessandra等[14]的免疫组化方法，未经线粒体途径凋亡的细胞中，Cyt-c主要位于线粒体内（内外膜之间），在胞质呈颗粒状分布，经线粒体途径凋亡的细胞，Cyt-c释放至胞浆，分布呈弥散性，单个细胞表现为对应抗原染色后光密度下降，相应区域内随着线粒体途径凋亡细胞个数的增加，平均光密度下降。本实验中Cyt-c的释放在模型组PASMCs明显减少，胞质线粒体绝大部分以颗粒状存在，说明线粒体膜完整性升高，抗凋亡能力增强，这一现象在肺微细动脉尤为明显，与慢性低O2高CO2肺动脉高压发病机制中肺微细动脉肌化的表现相符。肺匀浆caspase 9酶活性降低支持上述结果。根据实验结果，线粒体途径凋亡减少，参与了肺动脉重构过程。
线粒体Cyt-c和其他促凋亡成分的释放受到Bcl-2蛋白家族的调控，它们位于线粒体凋亡途径的上游。根据其功能可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。这两类结构相似而又相互拮抗的蛋白以Bcl-2和Bax为代表[5,6]。Bax等可以通过与腺苷酸移位酶（ANT）或电压依赖性阴离子通道（VDAC）的结合介导PT 孔的开放[11,13,14]，而Bcl-2则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者与促凋亡蛋白形成异源二聚体，阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应[15,16]。抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例在一定程度上决定了细胞是否发生凋亡，Bax/ Bcl-2高的细胞较Bax/Bcl-2低的细胞容易发生凋亡。本研究结果表明，低O2高CO2肺动脉高压大鼠PASMCs Bcl-2含量增加，Bax含量下降，因而Bax/Bcl-2值降低，抑制了线粒体途径的凋亡。
近年来研究发现增加PASMCs凋亡可以逆转肺动脉高压肺血管重建[17,18]。大量研究发现，葛根素能促进主动脉平滑肌细胞的凋亡[7，19，20]。本研究在低O2高CO2情况下，观察葛根素对线粒体途径细胞凋亡的影响。通过测量mPAP和光镜HE染色观察，发现葛根素具有降低低O2高CO2组大鼠mPAP和改善肺血管重构的作用。同时发现葛根素干预组PASMCs线粒体Cyt-c释放量较模型组显著增加，肺组织匀浆caspase 9活性较模型组显著增强；且干预组PASMCs胞浆Bcl-2表达量较模型组显著下降，Bax/Bcl-2值较模型组显著升高，表明葛根素改善低O2高CO2大鼠肺动脉重构可能与其促进PASMCs线粒体途径凋亡有关。
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