乙型肝炎病毒对肾小管上皮细胞直接作用的实验研究
【摘要】 目的:探讨乙型肝炎病毒（HBV）在体外对人肾小管上皮细胞（HKC）的直接致病作用。方法:① HBV体外感染HKC：培养的HKC传至6孔板中，接种密度为1×106个/ml，孵育24 h 后分受感染和阴性对照两组。受感染组加入0.5 ml HepG2.2.15细胞上清液（含有HBV）；阴性对照组加入0.5 ml 10% FCS-DMEM/F-12培养液。两组HKC继续孵育72 h，消化，离心沉淀，PBS清洗，实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ-PCR)检测两组HKC中的HBV DNA 含量。②HBV对体外培养的HKC细胞直接作用：HKC细胞传至24孔板中，接种密度为1×105个/ml，受感染组分三个亚组，分别加入100μl、200μl和300μl的感染用HepG2.2.15细胞上清液；阴性对照组为接种HKC后加入培养液常规培养；阳性对照组为HepG2.2.15细胞上清液。各组的每孔终体积均为2 ml，每组设3复孔。孵育72 h后收集各孔上清液，ELISA法检测转化生长因子β1（TGF-β1）的表达。结果:①受感染组HKC的基因组中检测到HBV DNA。②受感染组的三个亚组细胞培养上清的TGF-β1与阴性对照组比较差异均有显著性。结论:HBV可感染HKC并促进其分泌TGF-β1。
【关键词】 细胞培养技术；肝炎病毒，乙型；感染；HepG2.2.15细胞
Abstract: Objective: To investigate the direct pathogenic effects of Hepatitis B virus（HBV）on human tubular kidney cells (HKCs) in vitro. Methods: HKCs were infected by HBV: HKCs were seeded into six well cluster dishes, at 1×106 cells per ml. 24 hours later， HKCs were divided into control group and infected group. Cells of infected group were cultured with 0.5 ml supernatant of HepG2.2.15 cells, while 0.5 ml 10% FCS-DMEM/F-12 was used in control group. 72 h later, all of the HKCs were removed and then washed with PBS. HBV DNA was detected by fluorescent quantitation polymerase chain reaction (FQ-PCR). Direct pathogenic effects of HBV on HKCs: HKCs were seeded into twenty four well cluster dishes, at 1×105 cells per ml. Negative control group, positive control group and infected group were established. HKCs of infected subgroups were cultured with 100μl, 200μl and 300μl supernatant of HepG2.2.15 cells, respectively. Cells of negative control group were cultured with FCS-DMEM/F-12. Cells of positive control group were cultured with supernatant of HepG2.2.15. Supernatant from each well was collected after 72 hours. The expression of TGF-β1 was detected with ELISA. Results: HBV DNA was observed in the genome of HKC. In the HKC, persistent infection of HBV enhanced the expression of transforming growth factor β1（TGF-β1）. Conclusion: Human tubular epithelial cell is susceptible to HBV and HBV infection can enhance the expression of TGF-β1.
Key words: cell culture techniques; Hepatitis B virus; infection; HepG2.2.15 cell
乙型肝炎病毒（HBV）相关性肾炎的发病机制尚不清楚。虽然免疫复合物介导机制已被多数学者接受，但对于患者肾组织存在的HBV DNA和病毒抗原与肾炎发生的关系仍有争论，至今并不明确肾脏固有细胞对HBV的易感性。已知在免疫反应过程中，包括肾小管上皮细胞（HKC）在内的肾脏固有细胞可通过分泌转化生长因子β1（TGF-β1）等细胞因子介导炎症反应和影响肾脏病进展。已有研究发现慢性乙肝患者血清TGF-β1升高[1]。本实验以HepG2.2.15细胞作为提取病毒的来源，以体外培养的正常HKC为研究对象，进行了HKC对HBV易感性的探讨，同时观察了HKC在HBV作用下其TGF-β1的分泌情况。
1 材料和方法
1.1 试剂及仪器 细胞培养瓶、6孔和24孔细胞培养板（美国CORNING公司产品），DMEM/F-12、DMEM高糖型(美国Hyclone Lab 公司产品)，胎牛血清(购自杭州四季清)，G418(GIBCO公司产品)，TGF-β1的ELISA检测试剂盒（上海晶美生物工程有限公司产品），HbsAg和HbeAg的ELISA检测试剂盒（上海科华生物工程有限公司产品），HBV核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司产品）。
1.2 方法
1.2.1 HepG2.2.15细胞的培养：自武汉大学典型培养物保藏中心购取已贴壁生长的HepG2.2.15细胞，采用含10%胎牛血清、0.238% Hepes(pH7.0)、0.3%谷氨酰胺、380μg/ml G418、100 IU/ml青霉素和链霉素及以5% NaHCO3调pH至7.0～7.2的DMEM培养基，在5% CO2孵育箱37 ℃培养，细胞呈铺路石样贴壁生长，3～5 d换液一次。当长至约 80%融合时，予以传代。
1.2.2 HKC的培养：自武汉大学中国典型培养物保藏中心购取已贴壁生长的HKC，用10% FCS-DMEM/F-12培养基培养，以5% NaHCO3调pH 至7.0～7.2。在培养基加入100 IU/ml青霉素、链霉素、0.238% Hepes(pH7.0)和0.3%谷氨酰胺，在5% CO2 孵育箱37 ℃培养。细胞呈上皮样贴壁生长，3 d换液一次。当长至约80%融合时，予以传代。
1.2.3 感染用HepG2.2.15细胞上清液的制备：将HepG2.2.15细胞培养至约80%融合时，吸去培养瓶中的培养液并加入胰酶，吸取的培养液离心后留取上清，-70 ℃保存备用，称之为“阳性对照用HepG2.2.15细胞上清液”。从中收集经胰酶消化的HepG2.2.15细胞，制备成单细胞悬液，-70 ℃保存备用；然后将备用的冻存单细胞悬液反复冻融两个循环，离心后取上清，用于感染肾小管上皮细胞实验，称之为“感染用HepG2.2.15细胞上清液”。
1.2.4 HBV感染肾小管上皮细胞：将HKC传代至6 孔板，接种密度为1×106个/ml，24 h后进行HBV 感染实验。实验分组: ①受感染组：往孔板中加入制备好的感染用HepG2.2.15细胞上清液0.5 ml。②阴性对照组：加入0.5 ml 10% FCS-DMEM/F-12培养液。每组终体积均为2.0 ml。两组HKC继续孵育72 h后，0.25%胰蛋白酶+0.05% EDTA消化，吹打成单细胞悬液，离心，取沉淀，以PBS溶解后离心，反复洗3次后以200μl PBS溶解沉淀，同时吸取受感染组第3次洗液以备DNA提取后HBV DNA的检测。
1.2.5 ELISA法检测TGF-β1：将HKC培养至第3天，换液1次，待细胞生长至80%融合时传代并接种于96孔培养板，接种密度为1×105个/ml。实验分组：①受感染组各亚组：接种HKC后按加入感染用HepG2.2.15细胞培养上清液的体积分为3个亚组（体积数依次为100μl、200μl和300μl）。 ② 阴性对照组：接种HKC后只加入培养液。③阳性对照组：阳性对照为感染用HepG2.2.15细胞上清液，不接种HKC。每组设4复孔。受感染组及对照组的终体积均为2 ml。培养至第3天收集上清液, ELISA法检测各组细胞培养上清中的TGF-β1，检测步骤按照说明书进行，酶联检测使用DIALAB GMBH酶标仪，采用单波长(450 nm) 检测。
1.2.6 细胞培养上清和细胞中的DNA提取：采用蛋白酶K消化，酚、氯仿-异戊醇法提取细胞培养上清和细胞中的DNA(具体步骤参照[2]进行)。
1.2.7 FQ-PCR检测HBV DNA：培养细胞和细胞外液的HBV DNA的FQ-PCR测定按试剂盒使用说明书进行， PCR检测时设立受感染组、阳性对照(HbsAg阳性的乙型肝炎患者血清)、阴性对照(模板用HKC)、空白对照（ddH2O）及受感染组的第3次洗涤液；以上PCR产物均经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3 统计学处理方法 多个样本间计量资料的比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。
2 结果
2.1 HBV DNA的检测结果 实验中将受感染组HKC、感染用HepG2.2.15细胞上清液、HepG2.2.15细胞培养上清、受感染组第3次洗液及阴性对照组HKC均进行了DNA 提取及FQ-PCR测定（见表1）。PCR结果显示:受感染组HKC、感染用HepG2.2.15细胞上清液和HepG2.2.15细胞培养上清的HBV DNA 均阳性，受感染组第3次洗液和阴性对照组的HBV DNA均阴性。HBV PCR产物的电泳结果显示：受感染组HKC和阳性对照的PCR 扩增产物在100 bp处均出现特异性条带，而阴性对照组和受感染组第3次洗液的PCR 扩增产物没有出现特异性片段(见图1)。
2.2 细胞培养上清中TGF-β1的检测结果 对照组HKC上清液中的TGF-β1平均值高于感染用的HepG2.2.15细胞上清液；受感染组各组间TGF-β1的分泌呈上升趋势，但没有统计学差异；受感染组中100μl、200μl和300μl三个亚组的TGF-β1平均值分别与阴性对照组比较，差异均有显著性，见表2。
3 讨论
乙肝病毒相关性肾炎的发病机制未明，除目前较公认的抗原抗体免疫复合物致病学说外，尚有HBV直接感染肾脏、细胞免疫、自身免疫[3,4]、遗传[5-8]及社会生物学因素[9,10]等学说，其中HBV直接感染肾脏学说在近年备受关注。虽然HBV 是嗜肝DNA 病毒，但是其也有器官泛嗜性，除肝脏外也可感染机体其他器官组织（如肾、胰、皮肤、骨髓）以及外周单个核细胞等。临床分子生物学研究显示，乙型肝炎病毒相关性肾炎患者的肾小球和肾小管细胞中均存在HBV DNA和HBV RNA[11-16]。然而，关于HBV 的泛嗜性及HBV在肾脏原位复制等问题仍存在争议。有人质疑原位杂交技术检出患者近端肾小管上皮细胞内HBV DNA的意义，认为不排除来自肾小管重吸收的被动捕获的可能，且在肾脏局部检测到的HBV基因组DNA或RNA并不一定是局部病毒复制产生，也有可能源于循环中HBV感染细胞或者被细胞吞噬的病毒颗粒的局部滞留；特别是在采用PCR相关技术时很难排除血源污染[17]。以往的研究多停留在肾脏组织上，本研究首次采用体外细胞培养的方法，使用提取的HBV直接在体外感染培养的HKC，避免了体内血源性污染及肾小管重吸收的被动捕获的可能性。使用FQ-PCR方法直接定量观察经HBV感染后的HKC基因组中的HBV DNA拷贝数，发现受感染组中HKC基因组中HBV的拷贝数明显高于正常对照组。为排除感染用HepG2.2.15细胞上清液污染引起的假阳性，我们特别测定了受感染组HKC的第3次洗液，洗液的HBV DNA拷贝数低于最低检测值，结果提示HBV可感染HKC。但对于HBV是否能在体外培养的HKC中复制并原位表达其蛋白产物，尚有待进一步探讨。
有临床研究表明，乙肝病毒相关性肾炎患者肾组织HBV DNA的存在与疾病进展有关[13,18]。一些关于HBV本身对肾脏致病作用的机制的研究提示，HBV可能通过直接的细胞毒作用[19]、细胞调亡[20]或通过上调补体C3介导炎症和促进免疫复合物形成[1]。本研究的受感染组各亚组HKC上清中TGF-β1的浓度均明显高于对照组且差异存在显著性，显示HBV感染可促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β1，提示HBV本身有可能通过促进肾脏固有细胞分泌细胞因子介导对肾脏的致病作用。
【】
[1] Deng CL, Song XW, Liang HJ, et,al. Chronic hepatitis B serum promotes apoptotic damage in human renal tubular cells[J]. World J Gastroenterol 2006, 12(11): 1752-1756.
[2] 王安辉,门可,徐德忠,等. 乙型肝炎病毒阳性血清体外感染Hep G2细胞的实验研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志,2005,19(2):169-171.
[3] Lin CY, Lin CC, Chang GJ, et al. Defect of cell-mediated immune response against hepatitis B virus: an indication for pathogenesis of hepatitis-B-virus-associated membranous nephropathy[J]. Nephron,1997,76(2):176-185.
[4] 郭怡清. 乙型肝炎病毒相关肾炎[J]. 中华肾脏病杂志,1996,12(2):111-113.
[5] Park MH, Song EY, Ahn C, et al. Two subtypes of hepatitis B virus-associated glomerulonephritis are associated with dif- ferent HLA-DR2 alleles in Koreans[J]. Tissue Antigens,2003,62(6):505-511.
[6] Yamada Y, Mudryj M, Crombrugghe B. A uniquely conserved regulatory signal is found around the translation initiation site in three different collagen genes [J]. Biol Chem,1983,258(24):14914-14919.
[7] Bhimma R, Hammond MG, Coovadia HM, et al. HLA class I and II in black children with hepatitis B virus-associated membranous nephropathy [J]. Kidney Int,2002,61(4):1510-1515.
[8] Kim SE, Park YH, Chung WY. Study on hepatitis B virus pre-S/S gene mutations of renal tissues in children with hepa-titis B virus-associated membranous nephropathy [J]. Pediatr Nephrol,2006,21(8):1097-1103.
[9] Bhimma R, Coovadia HM, Kramvis A, et al. HBV and pro-teinuria in relatives and contacts of children with hepatitis B virus-associated membranous nephropathy [J]. Kidney Int,1999,55(6):2440-2449.
[10]Bhimma R, Coovadia HM, Ramjee G, et al. Characterization of proteinuria in asymptomatic family members and house-hold contacts of children with hepatitis B virus-associated membranous nephropathy [J]. Kidney Dis,2001,37(1):125-133.
[11]陈楠,王朝晖,任红,等. 肾组织中乙型肝炎病毒DNA和RNA的存在及其意义[J]. 中华医学杂志, 2001,81(21):1309-1312.
[12]黄朝兴, 吴淑珍, 李凡凡. 原位杂交检测乙型肝炎病毒DNA在肾脏的存在[J]. 医师进修杂志, 2000,23(3):34-35.
[13]Lin CY.Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid in kidney cells probably leading to viral pathogenesis among hepatitis B virus associated membranous nephropathypatients[J]. Nephron,1993,63(1):58-64.
[14]方利君,郭怡清,张月娥,等.小儿乙肝病毒相关性肾炎肾组织中乙型肝炎病毒DNA的存在状态[J].中华肾脏病杂志,1992,8(2):65-67.
[15]Zhang YE, Ma XL, Fang LJ,et al.The existence and signifi-cance of hepatitis B virus DNA in glomerulonephritis [J].Nephrology,1996,2(2):119-125.
[16]Lai KN,Ho RRH,Tam JS, et al. Detection of hepatitis B virus DNA and RNA in kidney of HBV-related glomerulonephritis [J].Kidney Int,1996,50(6):1965-1977.
[17]李刚,王力,周展眉.原位PCR技术检测肾组织乙肝病毒DNA的临床价值[J].实用医学杂志,2003,19(12):1312-1313.
[18]He XY, Fang LJ, Zhang YE, et al. In situ hybridization of hepatitis B DNA in hepatitis B-associated glomerulonephritis [J]. Pediatr Nephrol,1998,12(2):117-120.
[19]周士东,张月娥,郭慕依,等.肾小球肾炎肾组织中HbcAg的存在及其意义[J].中华肾脏病杂志,1995,11(2):104-105.
20. Ren J,Wang L,Chen Z,et al. Gene expression profile of transgenic mouse kidney reveals pathogenesis of hepatitis B virus associ-ated nephropathy [J]. Med Virol,2006,78(5):551-560.
