血清饥饿释放过程中Raji细胞内Skp2与p27kip1的表达变化及意义

                 作者：邵苏吉，陆建新，王燏婵，沈爱国，赵玥铭，张冬梅，程纯 

【摘要】  目的：探讨血清饥饿释放过程中淋巴瘤细胞株Raji细胞内Skp2与p27kip1的表达变化及意义。方法：采用免疫沉淀方法检测Raji细胞中p27kip1与Skp2的结合情况；采用血清饥饿合并释放同步化处理Raji细胞，经Western Blot技术检测该过程中p27kip1、Skp2在Raji细胞中的表达变化。结果：免疫沉淀结果显示在Raji细胞中p27kip1与Skp2能够相互结合。在Raji细胞血清饥饿释放过程中，Skp2蛋白总量增加，p27kip1蛋白总量减少。结论：在Raji细胞血清饥饿释放过程中Skp2合成增加，可能通过加快p27kip1的泛素化降解而使细胞中p27kip1显著减少，从而推动了细胞周期的进程。

【关键词】  Raji细胞株；p27kip1；S期激酶相关蛋白2

    [Abstract]    Objective: To investigate the expression variation and significance of Skp2 and p27kip1 during serum starvation and release process of Lymphoma cell line Raji cells. Methods: The combination of p27kip1 and Skp2 were detected by Immunoprecipitation in Raji cells. Raji cells were treated by serum starvation and release assay for synchronization purpose. The expression variation of p27kip1, Skp2 were detected by Western blot. Results: The results of immunoprecipitation suggest p27kip1 and Skp2 could form compound in Raji cell. During serum starvation and release process of Raji cells, the albumen amount of Skp2 increased, while the albumen amount of p27kip1 decreased. Conclusion: During serum starvation and release process of Raji cells, the  increased synthesis of Skp2 may speed up p27kip1 degradation via the ubiquitin-proteasome pathway, then p27kip1 decreased significantly, and then the cell cycle was put forward.

    [Key words]   Raji cell line ; p27kip1; S-phase kinase-associated protein 2

    p27kip1为CIP/KIP家族的主要成员，负性调节细胞周期的进程，是一个倍受瞩目的候选抑癌基因。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2，Skp2）为人类F-box蛋白家族成员，能够与Skp1、Cul1及Roc1/Rbx1结合形成具有E3泛素连接酶功能的SCF复合体（SCFSkp2），Skp2在其中发挥特异性底物识别作用，介导p27kip1的多聚泛素化及随后的蛋白酶体途径降解[1，2]。

    研究发现Skp2在人类多种肿瘤中都有异常表达，并且其表达水平与肿瘤组织的恶性程度及预后相关[3]。但是对于Skp2和 p27kip1在肿瘤细胞的增殖过程中的表达变化，国内外尚缺乏相关报道。

    本研究采用血清饥饿试验同步化处理淋巴瘤细胞株Raji细胞，使细胞周期阻滞在G1期，再通过血清释放试验促使细胞同步增殖，结合免疫沉淀、Western Blot技术检测了Raji细胞增殖过程中p27kip1、Skp2的表达情况，初步分析了Skp2、p27kip1在淋巴瘤细胞异常增殖中的作用。

    1   材料和方法

    1.1   材料

    1.1．1   细胞株   人类B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞由暨南大学组织移植与免疫部重点实验室惠赠。

    1．1.2   主要试剂   1640培养基（Gibco公司）。特级小牛血清（上海华美生物工程公司）。兔抗人p27kip1多克隆抗体p27（C-19）：sc-528，兔抗人Skp2p45（H-435）：sc-7164，（Santa Cruz公司）。β-actin单抗（Sigma公司）。SuperSignal west femto maximum sensitivity substrate（Pierce公司）。

    1.2   方法

    1.2．1   细胞培养   Raji细胞用1640完全培养基（含10%小牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素），5%CO2、37℃常规培养传代。收集处于对数生长期的细胞进行下述实验。各项实验至少重复3次。

    1.2．2   免疫沉淀   收集对数生长期的Raji细胞，以预冷的PBS洗涤2次，加入预冷的modifierd RIPA buffer，4℃轮转30 min，离心12000 g×10 min，取上清。将上清加入预冷的protein G，4℃轮转3 h，4℃离心12000 g×10 min，将上清移入一新的离心管。加入2 μg抗体p27kip1（C-19），4℃轮转1 h后加入预冷的protein G，4℃轮转过夜。离心12000 g×30 s，收集protein G，以800 μl预冷的modifierd RIPA buffer洗涤protein G 3次。将protein G重悬于60 μl 2×SDS上样缓冲液，沸水中煮5 min，收集上清，Western Blot检测沉淀及共沉淀蛋白质。

    1.2．3   Western Blot   收集处于对数生长期的Raji细胞，根据细胞计数结果加入含0.1%小牛血清的完全培养基，调整细胞密度为5×105个/ml，接种于数个培养瓶中，分别于0，24，48，96 h收集细胞；另取一部分细胞用含0.1%小牛血清的完全培养基培养48 h后更换为含10%小牛血清的完全培养基，继续培养4、8、12、24、48 h后分别收集细胞。PBS洗2次，用2×SDS匀浆缓冲液裂解细胞提取蛋白，紫外分光法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电湿转法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜。室温封闭（含20％脱脂奶粉的TBST）2 h。一抗[ p27kip1（c-19）1∶800，Skp2 p45（H-435）1∶500，β-actin 1∶1000]室温分别孵育60 min，4℃过夜。HRP偶联的二抗（1∶1000）室温孵育2h，ECL显色。

    2   结     果

    2.1   在淋巴瘤细胞Raji中p27kip1与Skp2能够相互结合   作为SCF复合体（SCFSkp2）的特异性底物识别亚单位，Skp2能够介导p27kip1的多聚泛素化及随后的蛋白降解[2]。因此，本研究首先采用免疫沉淀方法来验证Raji细胞中p27kip1与Skp2能否相互结合。结果表明，在Raji细胞中Skp2与p27kip1能够相互结合形成免疫复合物（图1）。

    2.2   淋巴瘤细胞Raji增殖过程中p27kip1与Skp2的表达变化   血清是强有力的丝裂原信号，通过血清饥饿可以将细胞周期阻滞在同一阶段（G1期），再通过血清释放刺激细胞同步生长，可以更准确地检测到在淋巴瘤细胞增殖过程中p27kip1及Skp2蛋白的表达变化。结果显示Raji细胞血清饥饿48h，细胞内p27kip1蛋白显著增加，并持续到96 h；而Skp2蛋白表达明显下调（图2）。为了避免血清饥饿时间过长而导致的细胞凋亡过多，本研究选择血清饥饿48h作为血清释放点，结果发现p27kip1蛋白水平在血清释放4 h开始下调，24 h后逐渐下降到稳定水平； Skp2的蛋白水平则在血清释放4 h开始增高，24 h后逐渐升高到稳定水平（图3）。

    3   讨      论

    细胞周期的失调、细胞的失控性生长是肿瘤发生的重要原因。p27kip1作为细胞周期负性调控因子，广泛抑制着多种细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶的活性，使细胞停滞在Gl期，从而实现其细胞周期调控功能。p27kip1的基因突变非常罕见、其mRNA在整个细胞周期中的表达水平也基本恒定，其调节主要依赖于翻译后机制，其中Skp2介导的细胞周期依赖性、底物特异性泛素/蛋白酶体降解途径对p27kip1表达水平的调节起着重要作用。

    已有研究表明在人类多种肿瘤组织内Skp2蛋白有高表达，并且与肿瘤组织的恶性程度及预后相关，多数学者认为，正是由于Skp2蛋白在肿瘤细胞中的异常表达导致了p27kip1蛋白降解过多，从而导致细胞周期的调节异常[4~6]。但对于Skp2与p27kip1在肿瘤细胞增殖过程中的表达变化目前尚缺乏相关研究。本研究采用血清饥饿合并血清释放试验促使淋巴瘤细胞株Raji细胞同步增殖，检测在此过程中Skp2与p27kip1表达变化。结果表明，血清饥饿使Raji细胞中Skp2的蛋白水平逐渐降低，p27kip1表达水平逐渐增高；血清释放刺激细胞增殖后则情况相反。研究提示在血清饥饿过程中Raji细胞中Skp2的合成逐渐减少，因而由它介导的p27kip1降解减少，由于p27kip1的合成相对恒定，从而导致p27kip1的积累，其细胞周期阻滞的作用得以发挥；血清释放后Skp2的合成逐渐增加，导致p27kip1降解加快，p27kip1的细胞周期抑制作用解除，细胞增殖得以进行。

    综上所述，在Raji细胞增殖过程中Skp2表达水平增高导致p27kip1降解增多，细胞周期向前推进。在许多肿瘤组织中Skp2表达水平显著高于正常组织，细胞中高水平的Skp2导致p27kip1的降解过多，细胞周期进程过快，这可能正是肿瘤细胞异常增生，细胞恶变的重要原因。然而，Skp2表达水平异常增高的原因是什么，或者说其上游的调控因子是什么，这些还有待进一步的研究。

【】
  [1] Ganoth D, Bornstein G, Ko TK, et al. The cell-cycle regulatory protein Cks1 is required for SCF(Skp2)-mediated ubiquitinylation of p27[J]. Nat Cell Biol, 2001, 3(3): 321-324.

[2] Zancai1 P, Dal Col J, Piccinin S,et al. Retinoic acid stabilizes p27Kip1 in EBV-immortalized lymphoblastoid B cell lines through enhanced proteasome-dependent degradation of the p45Skp2 and Cks1 proteins[J]. Oncogene, 2005, 24(15): 2483-2494.

[3] Latres E, Chiarla R, Schulman BA, et al. Role of the F-box protein Skp2 in lymphomagenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(5): 2515-2520.

[4] Woenckhaus C, Maile S, Uffmann S, et al. Expression of Skp2 and p27KIP1 in naevi and malignant melanoma of the skin and its relation to clinical outcome[J]. Histol Histopa-thol, 2005, 20(2): 501-508.

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