番荔枝内酯单体Desacetyluvaricin对肝癌细胞株生长和凋亡的影响
作者：陈孝银， 周光雄， 赵昌林 ， 夏芳， 毛慧君， 江振友， 敖杰男
【摘要】 【目的】 探讨Desacetyluvaricin在体外对肝癌HpG2.2.15细胞株生长和凋亡的作用及机制。【方法】 处于生长期的人肝癌HepG2.2.15细胞分为3组：对照组，Desacetyluvaricin组和顺铂组。用MTT法检测各组肿瘤细胞增殖情况，流式细胞仪检测各组细胞周期、细胞调亡以及凋亡基因Fas的表达情况，比较Desacetyluvaricin与顺铂的疗效。【结果】 Desacetyluvaricin对肝癌细胞增殖的抑制率高达62.2%。Desacetyluvaricin抑制肝癌细胞增殖的机制可能为阻滞肝癌HepG2.2.15细胞从G1期进入S期，从而抑制了肿瘤细胞的增殖，同时通过促进Fas表达，诱导HepG2.2.15细胞凋亡。其诱导Fas表达的效果还优于顺铂。【结论】 Desacetyluvaricin可能通过延缓细胞G1期及诱导细胞凋亡等机制，对肝癌细胞的增殖有一定的抑制作用。
【关键词】 Desacetyluvaricin; 肝癌; 细胞周期; 细胞凋亡; Fas基因 肝癌是常见的恶性肿瘤，早期手术切除是首选的、最有效的方法[1]，但多数病人发现肝癌时已属晚期，失去了手术机会[2]，因此，提高肝癌病人的生存率主要依赖早期诊断、早期手术及有效的综合治疗[3]。然而，包括顺铂在内的化疗药物均尚未被证实可提高肝癌病人的生存率[4]。番荔枝内酯是从番荔枝科植物中提取的一类化合物，研究显示大多数番荔枝内酯类化合物对体外培养的肿瘤细胞普遍具有强大的细胞毒作用[5]，其中一些单体如bullatacin还可逆转肿瘤细胞的多药耐药作用[6]，番荔枝内酯的研究已经成为国内外植物化学和肿瘤药研究的新热点。遗憾的是，目前已提纯的番荔枝内酯类化合物单体毒性太大,其体外的抗癌活性难以在体内重复,限制了其体内抗肿瘤作用的研究[7]。Desacetyluvaricin是从番荔枝科植物中提取出的一种新型化合物单体，为白色针状晶体，分子式为C37H66O6 [8]，其毒性较低。我们前期研究[9]发现含有Desacetyluvaricin的复方中药具有一定的抗乙肝病毒和肝纤维化的作用，并对一些抑癌基因的表达有一定促进作用，但是其是否对乙肝后肝癌及肝癌癌前病变有治疗或预防作用，其是否有抗肿瘤作用，以及作用机制等尚不确切。本研究采用MTT法，免疫荧光染色结合流式细胞仪，观察Desacetyluvaricin在体外对肝癌细胞株的影响，探讨其可能的作用机制。
1 材料和方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试剂 RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司。胎牛血清，医学院血液病研究所（天津）产品。胰蛋白酶，华美公司产品。四噻唑蓝、碘化丙啶（PI）及免疫荧光标记的Fas抗体，胰酶抑制酶（RNase），美国Sigma公司产品。
1.1.2 器材 倒置显微镜，37×AZ型，上海光学仪器厂。流式细胞仪（FACS）、酶联免疫检测仪，美国Becton Dickinson公司生产。相差显微镜，日本Olymapus公司产品。台式高速及低速离心机，上海医用分析仪器厂。
1.1.3 药物 顺氨氯铂（DDP），齐鲁制药厂生产，批号（91）861-82。Desacetyluvaricin（由暨南大学药学院周光雄博士提纯提供）。
1.1.4 癌株 肝癌HepG2.2.15细胞株，购自南方医科大学肝病研究中心。
1.2 方法
1.2.1 MTT法
液氮冻存的人肝癌HepG2.2.15细胞株经复苏后培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃，5％CO2培养箱中孵育。细胞贴壁生长后取对数生长期的细胞以备试验之用。选择对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化5～8 min，按每孔5 × 104/mL的密度加于96孔培养板中，每孔200 μL。分别加入200 μg/mL Desacetyluvaricin、 20 μg/mL 顺铂每孔10 μL，同时设置每孔加10 μL的培养液作为对照组和不接种细胞的空白孔。置37 ℃，5％ CO2培养箱中培养96 h，每24 h加入MTT10 μL/孔，孵育4 h后弃上清液，加入DMSO 150 μL/孔，轻轻振荡10 min左右，充分融解结晶物；在酶联免疫检测仪上以570 nm波长测定各孔光吸收值（A值）,并不同药物对HepG2.2.15细胞的生长抑制率 [10]。
1.2.2 流式细胞仪法
对数生长期的细胞，胰酶消化后，以5×104/mL的密度传代、接种，贴壁后加入DMEM 培养基培养24 h，分别加入200 μg/mL Desacetyluvaricin、20 μg/mL 顺铂每孔10 μL，加等体积的培养液作为对照组；继续培养48 h，胰酶消化成单细胞悬液，冰PBS 洗涤2次，1 000 × g离心5 min，弃上清，缓慢加入-20 ℃预冷的70%乙醇，4 ℃过夜。取细胞悬液，PBS洗涤，1 000 × g离心5 min后，弃上清。PI 染液1.0 mL染30 min，混合液过300目滤网以除去杂质，488 nm 激发波长测定样品，620 nm 带通滤片检测PI荧光。每样本收集多于10 000个荧光信号[11]。在流式细胞仪上作细胞凋亡、细胞周期和细胞Fas基因表达分析。计算细胞增殖指数(Proliferation Index ,PI)：PI=处于S期和G2期的细胞数/处于G1期、S 期和G2期的细胞数×100%。
1.2.3 统计学处理
所得数据均以表示，SPSS 13.0 统计分析软件包进行方差分析及均数间多重比较。
2 结 果
2.1 Desacetyluvaricin 抑制HepG2.2.15 细胞增殖
Desacetyluvaricin 的细胞生长抑制率为62.2%，DDP的抑制率86%，虽然Desacetyluvaricin的抑制率低于DDP的抑制率，但是已经明显高于50%的有效标准（表1）。
2.2 Desacetyluvaricin 对HepG2.2.15细胞周期的影响
与对照组相比，Desacetyluvaricin和顺铂均可增加处于G1期细胞数并减少S期细胞数，延长肿瘤细胞的G1期并阻碍其向S期转化。两者效果相比，没有显著差异（图1，表2）。
2.3 Desacetyluvaricin 诱导HepG2.2.15细胞凋亡
与对照组相比，Desacetyluvaricin和顺铂均可显著增加肝癌细胞的凋亡率，两者效果相比，没有显著差异（图2，表3）。
2.4 Desacetyluvaricin 诱导HepG2.2.15细胞Fas表达
如表4所示，Desacetyluvaricin组较对照组及顺铂组的Fas阳性细胞数为多，表明Desacetyluvaricin可能通过激活Fas基因诱导肿瘤细胞凋亡（图3）。
3 讨 论
番荔枝内酯类化合物对肿瘤细胞具有较强的细胞毒作用，对其抗肿瘤研究是目前国际上植物药研究的热点之一。中草药中有很多属于番荔枝科植物，开展番荔枝内酯的肿瘤药研究对中医药抗肿瘤研究有一定的普遍意义。然而目前提纯的大多数番荔枝内酯单体细胞毒性作用太强，阻碍了其体内试验的进行。为寻找新的低毒且具有良好抗肿瘤作用的番荔枝内酯单体，我们前期研究发现含有Desacetyluvaricin的中药复方，其有一定的抗乙肝病毒和肝纤维化的作用，并对一些抑癌基因的表达有一定促进作用[9]，但其是否对乙肝后肝癌及肝癌癌前病变有或预防作用，其是否有抗肿瘤作用等尚不明确。本研究我们以HepG2.2.15细胞株作为研究对象，从肿瘤发生的两大重要环节——逃逸凋亡和无限增殖入手，探讨了Desacetyluvaricin在体外对肝癌细胞株生长及调亡的影响。
MTT检测各组肝癌HepG2.2.15细胞增殖情况显示，Desacetyluvaricin对HepG2.2.15细胞的增殖具有明显抑制作用，其抑制效应强于顺铂。为进一步阐明Desacetyluvaricin 抑制HepG2.2.15细胞增殖的机制，我们从细胞周期角度进行深入研究。在细胞周期的进程中，从G1期向S期转变时存在一个被称为限制点（restriction point, R point）的调控点，G1期细胞通过此点可进入S期， 否则细胞周期的进程将发生滞留。肿瘤细胞的细胞周期中R点消失，其生长、分裂失去控制，因此阻止肿瘤细胞进入S期是抑制肿瘤细胞增殖的一个重要措施[12, 13]。流式细胞仪检测细胞周期结果显示Desacetyluvaricin 可减少S期细胞数并增加G1期细胞数，表明Desacetyluvaricin 延迟了肿瘤细胞G1期并阻碍其向S期转化，具有G0/G1期阻滞作用，从而抑制了肿瘤细胞增殖。其效果与顺铂相比，没有显著差异。
肿瘤发生机制的研究表明除细胞过度增殖这一途径外，凋亡不足、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径。肿瘤细胞逃逸调亡，将导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，使肿瘤细胞群体内存活与死亡的平衡被破坏，存活大于死亡，肿瘤细胞数目的净增长加大，因此诱导肿瘤细胞调亡是肿瘤治疗的又一重要手段[14, 15]。流式细胞仪检测细胞调亡的结果显示Desacetyluvaricin 可增加肿瘤细胞的凋亡率，显示出Desacetyluvaricin 良好的诱导凋亡作用。其效果与顺铂相比，没有显著差异。凋亡的分子机理十分复杂，许多基因的变化参与此过程，为进一步探讨Desacetyluvaricin诱导凋亡的机制，我们选取了经典促凋亡基因Fas[16]，研究Desacetyluvaricin对Fas表达的影响。免疫荧光染色结合流式细胞仪检测Fas阳性细胞结果显示，Desacetyluvaricin组较空白对照组及顺铂组的Fas阳性细胞数增多，表明Desacetyluvaricin可能通过激活Fas基因诱导肿瘤细胞凋亡，重新恢复肿瘤细胞群体内存活与死亡的平衡。
本研究结果显示Desacetyluvaricin可阻滞肝癌HepG2.2.15细胞的有丝分裂，从而抑制了肿瘤细胞的增殖，同时通过促进Fas表达，诱导HepG2.2.15细胞凋亡。其诱导Fas表达的效果优于顺铂。
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