富含血小板血浆和rhBMP-2复合物诱导兔下颌骨再生的实验研究
作者：蔡华雄, 宋洁文, 赵小朋, 阮毅, 郑美华, 李海刚
【摘要】 【目的】 研究自体富含血小板血浆（PRP）和人重组骨形成蛋白（rhBMP-2）对下颌骨组织形成的促进作用。【方法】 成年新西兰白兔45只，随机分为3组，每组15只，选择右侧下颌骨为实验侧、左侧下颌骨为对照侧。A组右侧下颌骨缺损区放置明胶海绵和PRP，B组右侧下颌骨缺损区放置明胶海绵和rhBMP-2，C组右侧下颌骨缺损区放置明胶海绵、PRP和rhBMP-2，各组左侧下颌骨缺损区只放置明胶海绵。分别于术后2、4、8周各取5只兔子进行放射性核素99mTc-MDP骨显像、X线片和组织学切片检查。【结果】 A组动物右侧放射性核素计数在术后2、4周时明显高于左侧（Ρ< 0.05）；B组动物右侧放射性核素计数在第4周时高于左侧（Ρ<0.05），而在第2、8周时低于左侧（Ρ< 0.05）；C组动物右侧放射性核素计数在第2、4周时均高于左侧（Ρ<0.05），在第8周时两侧没有明显差别（Ρ >0.05）。【结论】 PRP单独或与rhBMP-2复合均能促进下颌骨组织的增长。
【关键词】 富含血小板血浆; 骨形成蛋白; 骨再生
] 牙槽骨是支持、稳固牙齿、维护咀嚼功能的重要组织，由于炎症、外伤、肿瘤、功能性萎缩等原因，牙槽骨非常容易吸收、丧失，进而影响咀嚼功能。牙槽骨组织的吸收、丧失，导致牙齿松动（牙周炎），义齿、种植牙修复困难，进行牙槽骨移植是重建牙槽骨的重要手段。关于牙槽骨的移植，主要是选择植骨材料的问题。随着医学的不断，人们已经发现了众多可供移植的材料，如羟基磷灰石/脱矿骨复合物、医学组织工程材料支架等[1、2]，但至今为止尚未找到一种既安全、，又有理想效果的牙槽骨植骨材料。本实验通过同位素骨显影技术观察自体富含血小板血浆（platelet rich plasma, PRP）及人重组骨形成蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2）对兔下颌骨缺损区骨组织代谢的影响，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
45只健康成年新西兰白兔（南方实验动物中心提供），雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，分笼饲养。人重组骨形成蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2），由广州威佳科技有限公司提供。自体富含血小板血浆（PRP），手术前制备。以明胶海棉作为PRP及rhBMP-2的载体。
1.2 PRP的制备
0.03 g/L戊巴比妥钠（0.03 g/kg）腹腔注射麻醉，从兔耳中央动脉抽取5 mL自体血，装在预先放有0.5 mL复方枸橼酸钠抗凝剂的10 mL离心管中,参照Landeaserg法[3]进行PRP提取：将新鲜血分两次离心，第一次离心1 000 r/min（200 × g）×10 min，吸管吸取全部上清液至交界面下3 mm，移至另一离心管，平衡后再次离心1 000 r/min（200×g）×10 min，此时离心管中液体分为两层，吸取约3/4上清液弃掉，摇匀剩余液体，即为PRP，摇匀，备用。经检测，离心前血小板计数为336×109/L，离心后血小板计数为1 498×109/L，离心后的血小板浓度是离心前的450%左右。制作过程严格无菌操作。
1.3 手术与分组
健康成年新西兰白兔45只，随机分为A、B、C3组，每组15只。每只兔在双侧下颌骨体部，即近犬齿、前臼齿根尖处建立骨缺损区，右侧为实验侧，其中A组放置PRP和明胶海绵，B组放置rhBMP-2和明胶海绵，C组放置PRP、 rhBMP-2和明胶海绵；左侧为对照侧，均只放置明胶海绵。
1.4 实验方法
0.03 g/L戊巴比妥钠按0.03 g/kg腹腔注射麻醉，显效后在手术区局部注射0.02 g/L利多卡因。常规备皮、消毒、铺巾。沿下颌骨下缘作平行切口，长度为3～4 cm，分层切开皮肤、皮下组织，暴露下颌骨下缘及下颌骨颊面，用裂钻在下颌骨体部颊侧中下1/3处制备缺损区，长、宽、深分别为8 mm×6 mm×2 mm，手术时使用生理盐水降温，术后使用庆大霉素注射液冲洗防止感染。缺损区制备后，兔子右侧：A组以明胶海绵加PRP填塞，B组以明胶海绵加rhBMP-2填塞，C组以明胶海绵加PRP及rhBMP-2填塞；左侧均以明胶海绵填塞。严密缝合伤口，分笼饲养。术后给予青霉素肌注预防感染，剂量为40万U/次，每天一次，持续3 d。 1.5 观察指标
1.5.1 放射性核素骨显像 各组分别在术后第2、4、8周时随机抽取5只大白兔，由耳缘静脉注射962MBq99mTc-MDP，3 h后在全麻状态下将大白兔仰卧固定，取其下颌骨正面及双侧摄取相的静态骨显像。在双侧缺损区取约10 mm × 8 mm的面积作为感兴趣区（region of interest, ROI），使用高分辨准直器γ照相机（Millennium MG）进行骨显像，机软件分别计算每个ROI的平均放射性计数，并以下颌颏部正中同样面积的平均放射性计数比值相比较。为减少误差，测量时每个ROI的放射性平均计数重复测量5次，取平均值。在实验过程中对核医学医师采用单盲法。
1.5.2 X线片检查 经过核素检查后的大白兔，使用血管内注射空气法处死，取标本照X光照片，观察缺损区内新骨形成情况。
1.5.3 组织学观察 上述标本经100 ml/L福尔马林固定，50 ml/L硝酸脱钙，系列脱水，石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜观察。
1.6 统计分析
采用配对t检验，SPSS 11.5软件进行统计分析。
2 结 果
2.1 99mTc-MDP骨显像
A组动物实验侧放射性计数在第2、4周时明显高于对照侧（Ρ< 0.05），而8周时放射性计数与对照侧相比无显著性差别（Ρ >0.05）；B组动物实验侧放射性计数在第2、8周时低于对照侧（Ρ<0.05），而第4周时高于对照侧（Ρ< 0.05）；C组动物实验侧放射性计数在第2、4周时随着时间的推移明显增高，且明显高于对照组（Ρ< 0.05），到第8周时放射性计数明显降低，但与对照组相比无显著性差别（Ρ >0.05，见表1）。
2.2 X线检查结果
所有结果显示，兔子下颌骨缺损区在术后2周时清晰可见，到术后4周时，缺损区已经有骨组织生长，术后8周时，缺损区基本消失，骨组织恢复良好，各组之间、实验侧与对照侧之间没有明显差别(图1)。
2.3 组织学观察
A组和C组动物在术后2周时，实验侧骨组织呈迷路样增长，骨陷窝清晰可见，纤维组织比对照侧少，骨母细胞较多，部分为正方形，此时骨小梁排列仍不规则；8周时，实验侧和对照侧骨组织密度接近，实验侧骨细胞胞核大而黑，可见粘合线。
B组动物在术后2、4周时，实验侧和对照侧均可见较多的纤维组织，骨细胞的增殖较A、C组少，8周时骨组织基本成熟，两侧差别较小(图2）。
3 讨 论
PRP技术是以患者自体血为原料，通过梯度密度离心的方法获得富含血小板的血浆，再单独或联合其他生物材料注入硬组织缺损或软组织创伤处，从而修补缺损，诱导生长，加速局部创伤的愈合并提高愈合质量。其作用的发挥有赖于PRP中浓缩血小板脱颗粒后产生的各类高浓度生长因子以及纤维蛋白原所形成的纤维网状支架〔4〕。PRP中主要的生长因子是转移生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）、类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor, IGF）等〔5，6〕。1998年Marx等〔7〕首次将PRP技术用于肿瘤术后病人的下颌重建，发现PRP可明显加速骨形成率，促进更多的骨质形成及矿化。Stefani等〔8〕在狗前磨牙牙槽窝做种植实验，在植入种植体时加入血小板来源生长因子（PDGF-BB）及胰岛素样生长因子（IGF-1）的混合物，3、8、12周后进行观察，发现种植体与骨的接触面积和骨密度均高于对照组。Rosenberg等〔9〕将富含血小板血浆（PRP）应用于上颌窦植骨术，取得良好效果。Kassolis等〔10〕采用自体PRP复合冻干骨为15例患者施行上颌窦升高术及牙槽骨增高术，共有36块植入体，12个月后32块（89%）获得成功，X线检查移植体与骨界面紧密结合，另外4块移植体由于手术暴露而松动，进行组织学检查发现冻干骨周围已有相当数量的骨样或骨组织形成，没有明显的炎症细胞浸润。Bellie等〔11〕在人颌骨囊肿摘除术后骨缺损区植入自体PRP和牛羟基磷灰石颗粒复合物，发现该复合物有促进骨增长和组织愈合的作用。Goto 等〔12〕在移植PRP和成骨细胞复合物到SCID小鼠的皮下的实验中发现，PRP在体外能提高碱性磷酸酶的活性，促进矿化颗粒的形成，在体内能促进成骨细胞的分化。Gerard等〔13〕在狗的下颌骨缺损区植入自体骨和PRP，对照组只植入自体骨，组织学观察发现术后1～2个月实验组移植骨数量明显减少，新骨数量明显增加，有统计学差异，但该现象到3～6个月时消失，两组统计学无差异。本实验从组织学观察中发现，兔下颌骨缺损区在加入PRP及明胶海绵后，在第2、4周时，骨细胞形成的活跃程度要明显高于只加入明胶海绵的对照侧，到8周时，两侧的骨小粱密度又趋于一致。
但是，也有学者在研究PRP的过程中发现不同的结果。Weibrich等〔14〕将PRP应用于体外培养成骨细胞，结果发现，加入适当浓度的PRP可以促进细胞的生长，但PRP的浓度过高，反而会轻度抑制细胞生长。Wiltfang 等〔15〕将PRP分别复合自体骨、磷酸三钙颗粒、小牛骨后植入小型猪前额骨缺损区，结果发现PRP在早期能促进自体骨的再生，而对异种骨及骨代替品没有作用。Aghaloo等〔16〕用自体骨加PRP修复兔颅骨8 mm的缺损，通过对比，认为加入PRP并未明显促进骨的生成。
BMPs是一类特殊的骨生长因子，在一定环境下，可诱导未分化间叶细胞、骨髓中的骨母细胞分化成为成软骨细胞和成骨细胞，进而诱导软骨和骨的形成，rhBMP被认为是BMP家族中诱导骨形成活性很高的生长因子。所以，Carlson〔17〕撰文提出应用PRP+BMP是21世纪颌骨移植的新方向。但是，在PRP复合rhBMP-2后，对骨组织增长的作用方面，研究的不多。Jung 等〔18〕研究PRP及成品纤维蛋白复合rhBMP-2后对新西兰白兔骨再生的影响，发现单独使用PRP或成品纤维蛋白时，新骨形成与空白对照组相比虽然有所增加，但无显著性差异，而复合rhBMP-2后，两组对骨组织的增殖作用均明显增强，和对照组相比有显著性差异，不过PRP组和成品纤维蛋白组之间差异不明显。本实验中，单独使用rhBMP-2的B组动物，左右两侧下颌骨缺损区的组织学切片无论是在各时间段，均没有显示明显的差别，但在复合PRP后，各时间段的骨细胞密度、骨小梁数量均高于对照侧。
99mTc-MDP是一种亲骨性很强的有机膦酸盐,在体内可与骨组织中的羟基磷灰石晶体发生离子交换,并可与未成熟的骨胶原纤维结合,从而吸附于骨表面，而骨组织对放射性核素的摄取量主要取决于局部骨组织的血流量,骨矿物质代谢活性和成骨情况，血供丰富,成骨活跃,则呈现放射性核素浓聚区,反之则呈现核素冷区〔19〕，因此可根据植骨区放射性浓聚程度判断移植骨的血供重建和成骨活性〔20〕。本实验的核素检查结果发现，单纯使用PRP时，第2、4周的放射性计数高于对照组，与组织学观察显示的结果一致。
应用自体富含血小板血浆促进牙槽骨再生的研究，国外已见的报道主要是关于PRP与其它骨移植材料一起植入牙槽骨并促进牙槽骨的形成方面的研究，由于需使用其它的植骨材料（如羟基磷灰石、生物活性玻璃、珊瑚、胶原、去抗原的异体骨等）作为载体，仍不可避免受载体材料所存在的缺点的局限。Park等〔21〕则使用聚氨基葡糖海绵为血小板来源生长因子（PDGF-BB）的载体植入牙周骨组织缺损区，取得良好的刺激骨组织再生的效果，而同为生物材料的BMP与PRP 混合后植入骨腔，能否更快地促进牙槽骨的形成，则鲜有报道。本实验将PRP与rhBMP-2复合在明胶海绵上，结果表明，在第2、4周时，放射性核素的聚集明显高于对照组，到8周时，核素计数明显下降，提示此时骨组织已经接近成熟。
关于PRP的提取方法，采用离心法即可提取。Marx等〔7〕用此法提取到浓度是血液的338%的PRP，应用于骨移植，经检测表明加入PRP者骨发育成熟度是不加PRP者的1.62～2.16倍，组织形态学检查证实，实验组骨密度增加了（74%×11%）。本实验采用Landeaserg法[3]进行PRP提取，能提取到是原血液浓度450%的PRP。
由于兔的颌骨较小，犬齿、前臼齿靠后且细小，牙槽骨不明显，难以做拔牙后观察牙槽骨的手术，因此以下颌骨下缘代替，取犬齿、前臼齿根尖处的颌骨作为观察区。
在所有的X光照片中，实验侧与对照侧的对比不明显，可能是由于骨缺损区太小，骨组织的变化在X光片上难以显示明显的差别，所以对于本实验来说，X线观察不是一个理想的指标。
PRP单独或与rhBMP-2复合均能促进骨组织的增长。
(致谢：广东省人民核医学科)
【】
陈松龄,王大章,冉 炜,等.羟基磷灰石/脱矿骨复合物增高牙槽骨的实验研究 [J]. 中山大学学报:医学版,2000,21(4):280-283.
冉 炜，郭 冰，李 轶,等.可降解骨组织工程支架材料修复下颌骨缺损的实验研究[J].中山大学学报:医学科学版,2004,25(3S):18-20.
LANDESBERG R, ROY M, GLICKMAN R S. Quantification of growth factor levels using a simplified method of platelet-rich plasma gel preparation[J]. J Oral Maxilofac Surg 2000, 58: 297-300.
GARG A K, GARGENESE D, PEACE I. Using platelet-rich plasma to develop an autologous membrane for growth factor delivery in dental implant therapy [J]. Dent Implantol Update, 2000, 11(6): 41-44.
MARX R E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP [J]. Implant Dent, 2001, 10(4): 225-228.
WEIBRICH G, KLEIS W K, HAFNER G. Growth factor levels in the platelet-rich plasma produced by 2 different methods: curasan-type PRP kit versus PCCS PRP system[J]. Int J Oral Maxilofac Implants, 2002, 17(2):184-190.
MARX R E, CARLSON E R, EICHSTAEDT R M, et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts［J］. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 1998, 85(6):638-646.
STEFANI C M, MACHADO M A, SALLUM E A, et al. Platelet?鄄derived growth factor/insulin?鄄like growth factor?鄄1 combination and bone regeneration around implants placed into extraction sockets: a histometry study in dogs [J]. Implant Dent, 2000, 9(2): 126-131.
ROSENBERG E S, TOROSIAN J. Sinus grafting using platelet-rich plasma-initial case presentation[J]. Pract Periodontics Aesthet Dent, 2000, 12(9): 843-850.
KASSOLIS J D, ROSEN P S, REYNOLDS M A. Alveolar ridge and sinus augmentation utilizing platelet-rich plasma in combination with freeze-dried bone allograft: case series［J］.J Periodontol, 2000, 71(10):1654-1661.
BELLI E, LONGO B, BALESTRA F M. Autogenous platelet?鄄rich plasma in combination with bovine?鄄derived hydroxyapatite xenograft for treatment of a cystic lesion of the jaw［J］. J Craniofac Sury, 2005, 16(6): 978-980.
GOTO H, MATSUYAMA T, MIYAMOTO M, et al. Platelet-plasma/osteoblasts complex induces bone formation via osteoblastic differentiation following subcutaneous transplantation［J］. J Periodontal Res, 2006, 41(5):455-462.
GERARD D, GARLSON E R, GOTCHER J E, et al. Effects of platelet?鄄rich plasma on the healing of autologous bone grafted mandibular defects in dogs［J］. J Oral Maxillofac Sur, 2006, 64(3):443-451.
WEIBRICH G, GNOTH S H, OTTO M, et al. Growth stimulation of human osteoblast?鄄like cells by thrombocyte concentrates in vitro[J]. Mund Kiefer Gesichtschir, 2002, 6(3):168-174.
WILTFANG J, KLOSS F R, KESSLER P, et al. Effects of platelet-rich plasma on bone healing in combination with autogenous bone and bone substitutes in critical-size defects. An animal experiment[J]. Clin Oral Implants Res, 2004, 15(2): 187-193.
AGHALOO T L, MOY P K, FREYMILLER E G. Investigation of platelet-rich plasma in rabbit cranial defects: A pilot study[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2002, 60(10): 1176-1181.
CARLSON E R. Bone grafting the jaws in the 21st century: the use on platelet-rich plasma and bone morphogenetic protein [J]. Alpha Omegan, 2000, 93(3): 26-30.
JUNG R E, SCHMOEKEL H G, ZWAHLEN R, et al. Platelet-rich plasma and fibrin as delivery systems for recombinant human bone morphogenetic protein-2 [J]. Clin Oral Implants Res, 2005, 16(6): 676-682.
潘中允.临床核医学［M］.北京:原子能出版社,1994：271-291.
TRIPLETT R G, KELLY J F, MENDENHALL K G, et al. Quantitative radionuclide imaging for early determination of fate of mandible bone grafts [J]. J Nucl Med, 1979, 20(4):297-302.
PARK Y J, LEE Y M, PARK S N, et al. Platelet derived growth factor releasing chitosan spong for periodontal bone regeneration [J]. Biomaterials, 2000, 21(2): 153-159.
