剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达
【摘要】 目的：本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因，构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法：用PCR法扩增SRp55基因，将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收，连接载体和目的片段，获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。在大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG进行诱导表达，然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠，亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果：SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21（DE3）表达，随诱导时间的增加蛋白表达量增高，4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白，经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论：成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并获得GST-SRp55融合蛋白，为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。
【关键词】 SRp55 Tau 原核表达 剪接因子
[Abstract] Objective: To express and purify Glutathione S Transferase(GST)-fusion protein of SRp55, a splicing factor, in E.coli cells. Methods: The cDNA of SRp55 was amplified by polymerase chain reaction(PCR) and inserted into pGEX-2T with BamH1 and EcoR1 restriction sites. The recombinant plasmid of pGEX-2T/SRp55 was transformed into E.coli cells to express GST-SRp55. The expressed GST-SRp55 in the E.coli cells was purified from the extract by affinity purification. The purity of GST-SRp55 was analyzed by SDS-PAGE or Western blot. Results: The SRp55 was inserted into pGEX-2T with correct open read frame. The expression of GST-SRp55 could be induced by adding Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in a time-dependent manner. The expression level achieved the highest after adding IPTG for 4 hours. The purified GST-SRp55 by glutathione (GSH)-agarose beads showed a ~ 60 kD major band by coomassie blue staining, which also was recognized by anti-GST antibody. Conclusion: GST-SRp55 is expressed and purified successfully from E.coli cells，which will help us to further study the regulation of tau splicing.
[Key words] SRp55；Tau；Prokaryotic expression
整个人类DNA序列分析的完成使得我们认识到真正参与编码的基因只有2万多个[1]，远低于原来预料的10万个。其中60％的基因可通过不同的剪接产生多个剪接变异体，从而使得人类蛋白质更加多样[2]。不同的剪接产物是顺式作用元件和反式作用因子共同作用的结果。反式作用因子是指与DNA或RNA作用并调节其转录、剪接和翻译的蛋白质总称。参与RNA剪接的反式作用因子主要包括SR和hnRNP家族蛋白两大类。SR蛋白家族是一高度保守的剪接因子家族，它因其在羧基端富含精氨酸/丝氨酸（arginine/serine）二肽结构的结构域（RS domain）而得名[3]。SR蛋白通过它带有的1个或2个拷贝的RNA识别基序（RRM）与RNA结合，并决定各SR蛋白的底物特异性，因此RS结构域介导蛋白之间的相互作用[4]。
Tau蛋白是存在于神经元中主要的微管相关蛋白，其功能是促进微管聚合和稳定微管结构。在正常人脑中，tau蛋白有6种变异体，而这6种变异体是由单一的基因编码通过不同的剪接而形成的。其中，外显子10的编码与否决定了tau蛋白含有4个或3个微管结合重复片断（4 repeats or 3 repeats, 4R或3R）[5]。在正常人脑中，3R和4R的比例大约是1∶1，但在某些17号染色体连锁性前额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP－17)的病人脑中，由于某些突变引起外显子10的编码，使得4R和3R的比例大于1[6]。而在某些神经退行性疾病中，由于tau基因第280位编码精氨酸的核苷酸缺失，只产生编码3R的tau蛋白，从而使得其结合微管的能力降低[7]。因此，tau蛋白的剪接正确与否与某些神经退行性疾病有关。在胚胎的人脑中，只有3R的存在，没有外显子10的编码[8]。基于胚胎和成年组织的DNA结构的同一性，造成胚胎和成年人脑tau蛋白表达不同显示反式作用因子在tau蛋白可变剪接中的重要调控作用。因此探讨和研究参与tau蛋白剪接的剪接因子将有助于我们揭示tau蛋白的剪接机理，为某些神经退行性疾病的预防和提供有价值的依据。
SRp55是SR蛋白家族中的成员之一，已经发现它参与许多蛋白包括tau蛋白的剪接，它的功能受磷酸化调控。为了更好地研究SRp55，特别是SRp55蛋白磷酸化在tau蛋白剪接中作用的研究，我们构建了谷胱甘肽硫转移酶（GST）和SRp55融合的原核表达质粒，并在大肠杆菌中成功地诱导表达，分离纯化得到了GST-SRp55融合蛋白。这为以后我们对Tau可变剪接机制的研究提供了必要的基础。
1 材料和方法
1.1 材料 （1）实验菌株和质粒：E.coli菌株BL21(DE3)由本实验室保存，pGEX-2T为Amarsham公司产品，pCEP4-SRp55真核表达质粒由中研院生物医学研究所谭婉玉馈赠；（2）抗体和显色剂：抗GST抗体购自上海睿星基因技术有限公司，辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体和显色剂ECL购自美国Pierce公司；（3）其他试剂和材料：BamH I和EcoR I 为NEB公司产品；T4 DNA连接酶、Taq DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker DL2000、λDNA/Hind Ⅲ Marker为TaKaRa公司产品；凝胶回收DNA试剂盒（DNA Extraction Kit）为上海飞捷生物公司产品；琼脂糖为Promega 公司产品；预染蛋白marker购自Fermentas公司；IPTG和蛋白酶抑制剂cocktail为美国Sigma公司产品；BCA蛋白定量试剂盒购自上海申能博彩生物公司；用于纯化GST融合蛋白的谷胱甘肽球珠为北京威格拉斯公司产品；扩增SRp55基因的PCR引物由英骏生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 原核表达质粒pGEX-2T/SRp55的构建 根据GenBank报道的SRp55完整CDS序列,以pCEP4-SRp55为模板，选择BamHI和EcoR I酶切位点，以上游5’cgggatccatgagctacggccgcccccctcccg3’；下游5’cggaattcttaatctctggaactcgacctggac 3’为引物，通过PCR扩增目的基因, 反应条件为98℃ 预变性3min，98℃ 10s及68℃ 1min 45s，共进行35个循环，最后68℃ 10min。
用DNA Extraction Kit，按说明书介绍方法纯化PCR产物。纯化的PCR产物和pGEX2T质粒分别用BamH I 和EcoR I进行酶切,电泳鉴定并用DNA Extraction Kit回收PCR产物和pGEX-2T的酶切产物。然后，将酶切后的pGEX-2T和SRp55在22℃反应4h以连接，连接产物转化BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素选择培养后，挑取单个菌落，接种于含氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中37℃培养 8h。通过离心回收菌体，抽提质粒，用限制性内切酶BamH I 和EcoR I进行双酶切鉴定。同时将提取的重组质粒进行测序鉴定。
1.2.2 重组蛋白的诱导表达 将含pGEX-2T/SRp55及pGEX-2T的BL21大肠杆菌分别培养于5ml LB培养液中37℃ 过夜。次日吸取重组菌液1ml加入100ml含氨苄青霉素LB液体培养基中大量扩增至OD600为0.6左右，加入IPTG 0.4mmol/L诱导表达重组蛋白，在诱导培养的不同时间（0、2、3、4、5h）采集菌液，7000rpm离心10min后取沉淀，－20℃保存待用。以相同方法诱导GST表达作对照。
将收集的IPTG诱导培养各时间段细菌菌体直接加入SDS凝胶电泳上样缓冲液（不含β－巯基乙醇和溴酚蓝）裂解细菌，煮沸5min后，用BCA法测定蛋白浓度，然后加入β－巯基乙醇和溴酚蓝。
1.2.3 GST-SRp55融合蛋白的纯化 将IPTG诱导表达后的菌体用菌体裂解液（50mmol/L Tris-HCl pH 7.4，150mmol/L NaCl,2mmol/L EDTA，250μl cocktail/g 细菌菌体）在冰浴中进行超声破碎（相关参数为：功率500W，总时间30s，超声破碎1s，间隔2s）以裂解细菌，然后加入1％Triton X-100，13 000rpm离心15min后的上清液与谷胱甘肽-琼脂糖球珠于4℃孵育4～6h，用TBS缓冲液洗，然后用10mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱GST融合蛋白，-80℃保存待用。
2 结 果
2.1 SRp55 cDNA扩增 以质粒pCEP4-SRp55为模板进行PCR扩增。所获PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（见图1）。 结果显示PCR扩增的主要产物为1000 bp左右(图1)，与预计的SRp55 cDNA大小相符。
2.2 GST-SRp55融合蛋白在大肠杆菌中的表达 由于SRp55 cDNA被插入pGEX-2T多克隆位点的BamH I 和EcoR I之间。因此，我们对重组质粒pGEX-2T/SRp55进行酶切鉴定。如图2所示，此重组质粒经BamH I 和EcoR I双酶切后得到一个约1000 bp的小片段和一个约5000 bp的大片段，说明PCR扩增出的SRp55 cDNA已经成功插入到质粒pGEX-2T的多克隆位点中。对此插入片断进行序列分析，测得目的片段全长为1086 bp，与插入的SRp55 cDNA片段大小一致，BLAST分析其DNA序列证实此插入片段为SRp55 cDNA，并有正确的开放阅读框架。
以重组质粒pGEX-2T/SRp55转化大肠杆菌BL21(DE3), 经0.4mmol/L IPTG诱导表达1~5h后，收集菌体沉淀，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析菌体裂解液中的总蛋白，可见在约60kD处，有一时间依赖性可诱导的特异性蛋白表达（图3A），并且在IPTG诱导4h后，其表达量达到最高(图3A)。pGEX-2T本身在约28kD呈现一可诱导表达。
用蛋白质印迹分析以上的细菌裂解产物中GST-SRp55诱导表达。发现此约60kD的特异蛋白可被抗GST抗体识别，证实此为GST融合蛋白。GST蛋白在加入IPTG两小时后表达量趋于稳定（图3B）,GST-SRp55融合蛋白在四小时进入表达平台期（图3B）。蛋白印迹分析证实质粒构建成功（图4）。
2．3 GST-SRp55融合蛋白的纯化 将诱导后的细菌菌体超声破碎后，按所述方法，用谷胱甘肽－琼脂糖球珠亲和纯化GST-SRp55融合蛋白，然后用SDS-PAGE和western blot分析纯化的蛋白。结果显示，纯化的GST-SRp55融合蛋白经考马斯亮蓝染色为单一条带（图4A），分子量在60 kD左右。蛋白印迹分析显示此纯化的蛋白质可被抗GST抗体识别（图4B），提示此纯化的融合蛋白为GST-SRp55。
3 讨 论
真核生物经转录形成的pre-mRNA需经过加工，才能产生成熟的mRNA进入胞浆。在人体内这种加工方式主要包括两种：结构性剪接和可变剪接。前者是指一个基因只产生一种转录体；后者是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接变异体的过程。可变剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。剪接过程受多种顺式作用序列和反式作用因子相互作用调节。包括SR和hnRNP两大家族蛋白在内的多种剪接因子参与这一调节过程。4R Tau和3R Tau的形成离不开SR蛋白家族的参与，目前已有不少SR蛋白家族的成员被证实参与了Tau的可变剪接[9]。为研究剪接因子SRp55在tau蛋白剪接中的作用，我们表达了GST-SRp55融合蛋白。
基因工程表达系统有多种，表达系统由表达载体和宿主菌两部分构成。目前，大肠杆菌表达系统已经成为应用最为广泛的经典表达系统。本实验采用的BL21(DE3)是一种可以进行原核表达和酶切鉴定的大肠杆菌，重组目的蛋白在其中表达的稳定性较高，符合实验要求。我们将全长编码区的SRp55基因克隆到原核表达质粒pGEX-2T中，构建了pGEX-2T/SRp55重组质粒。用其转化大肠杆菌BL21（DE3）后，进行了酶切鉴定，表明 SRp55基因成功的构建到pGEX-2T中。克隆的SRp55基因序列分析结果经BLAST比对与GenBank中的相对应序列的同源性达100%，并以正确的阅读框架被插入pGEX-2T。本实验在30℃条件下，诱导前OD600为0.6时开始诱导，加入IPTG诱导培养5 h，随诱导时间的增加融合蛋白的表达量增加，4 h以后接近最高表达量。
在本实验中，我们发现原核诱导表达的GST-SRp55的分子量在60kD左右，去除融合的GST的分子量26kD，SRp55本身的分子量约为35kD，比来源于真核细胞的55kD小。SRp55蛋白分子量的理论值在35kD左右，与本实验一致。但在真核细胞中，SRp55由于多个位点被磷酸化，使得其在SDS-PAGE上的迁移减慢至55kD表观分子量[10]。对来源于真核细胞的SRp55蛋白经去磷酸化处理后，使得其迁移明显减慢[11]。
本研究显示我们已成功表达并纯化了GST-SRp55融合蛋白。这为我们研究参与调控SRp55蛋白的磷酸化进而影响tau的剪接蛋白激酶和磷酸酶提供了关键资源。
【】
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