缬沙坦对自体移植静脉内膜Fas、FasL表达的影响
【关键词】 血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂；自体移植静脉；Fas；Fas配体
[Abstract] Objective：To investigate the effect of Valsartan on intimal proliferation, and the expression of Fas and FasL on neointima，and to explain its mechanism of preventing restenosis in rabbit autogenous vein graft. Methods：20 male New Zealand White rabbits were randomly divided into two groups. The right external jugular veins of 20 rabbits were interposed between ipsolateral common carotid arteries. The control group was fed with common diet, and the treatment group was fed with common diet and valsartan (10mg·kg-1 ·d-1) . At the end of 4 weeks, the vein grafts were harvested and examined with pathologic and morphologic analysis. Fas and FasL on neointima were analyzed with immunohistochemical method. Results：Compared with the control group, the neointimal thickness and size were reduced in the treatment group (P<0.01). The expression of Fas and FasL in the treatment group was significantly higher than that in the control group(P<0.05). Conclusion：Valsartan could significantly prevent intimal hyperplasia in rabbit autogenous vein graft. The mechanism possibly invloved in its increasing the expression of Fas and FasL, and thus increasing the apoptosis of VSMC.
[Key words] Angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonists；Autogenous vein graft；Fas；FasL
在血管内膜增生过程中，血管平滑肌细胞存在明显的凋亡现象，在一定程度上减轻了再狭窄病变，Fas- Fas配体（FasL）系统是移植血管再狭窄过程中的主要凋亡途径[1]。本课题通过观察缬沙坦对移植静脉内膜Fas、FasL表达的影响，探讨血管紧张素Ⅱ1型（AT1）受体拮抗剂对移植静脉内膜增生的抑制作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 新西兰大白兔20只（由南通大学实验动物中心提供），体重2.5±0.5 kg，微生物控制级别为Ⅰ级，普通环境中喂养，自由饮水。随机分成2组，每组10只：（1）对照组予自体静脉移植手术，普通饲料饲养；（2）缬沙坦组在对照组自体静脉移植手术基础上予普通饲料+缬沙坦（10 mg·kg-1·d-1）喂养，两组均饲养4周。
1.2 建立自体静脉移植模型 兔手术前禁食、禁水4小时，建立耳缘静脉通道，予3%异戊巴比妥按30 mg/kg行静脉麻醉。仰卧位固定，颈部备皮，颈前正中纵行切口，游离、切取颈外静脉一段，肝素-生理盐水冲洗、浸泡。游离右侧颈总动脉，耳缘静脉内注射1%肝素1 ml/kg，使其肝素化，阻断颈总动脉近、远段，切除相应长度，静脉倒置，采用8/0锦纶单丝线作端-端间断吻合，约8~10针，两端吻合完成后开放动脉夹排气，确定静脉桥通畅、无出血后，逐层缝合切口。送回单笼喂养，术后3天每日耳缘静脉注射1%肝素1 ml/kg防治血栓，注射青霉素80万单位预防感染。手术次日及取标本当日行血管彩色多普勒检查，证实静脉桥通畅。
1.3 取材、切片与Fas、FasL检测 术后4周，再予3%异戊巴比妥静脉麻醉，游离静脉移植物，快速、准确切取所需移植物组织，置入10%甲醛中固定24小时，组织修整、洗涤，乙醇逐级脱水，二甲苯置换出组织块中酒精，石蜡包埋，切片厚4 μm，苏木素-伊红染色，封片，光镜观察。用Olympus BX50生物显微镜和北航医学图像分析系统进行图像分析，血管腔内膜的厚度、面积及中膜的厚度、面积。用S-P法进行Fas、FasL免疫组化检查，试剂盒购自Neo Markers公司，免疫组化阳性颗粒为棕黄色或棕褐色颗粒，分布在细胞膜及细胞浆中。在Olympus BX50显微镜和北航医学图像分析系统上随机计算5个400倍视野中阳性细胞数（P）及观察细胞总数（A），得出阳性细胞百分率（P/A，%）。
1.4 统计学方法 计量资料采用■±s表示，数据分析使用Stata7.0统计软件包。组间样本均数比较采用非配对t检验，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 动物情况 实验过程中动物无死亡，术后切口无感染，两组移植静脉无闭塞。
2.2 HE染色切片机图像分析
2.2.1 病理 肉眼可见对照组移植物管壁增厚，缬沙坦组管壁增厚不明显。光镜下，对照组移植物内膜明显增厚，管腔缩小，内膜下出现大量平滑肌细胞(SMC)增殖，增殖的SMC排列紊乱，呈典型的分泌型细胞，细胞周围有较多的胶原纤维，中膜稍有增厚；缬沙坦组内膜增厚较对照组减弱，中膜SMC向内膜下迁移、增殖较对照组明显减轻，中膜增厚不明显（图1）。
2.2.2 移植静脉管壁内膜、中膜厚度及面积改变 对照组与缬沙坦组内膜厚度及面积比较差异均有统计学意义（P<0.01）。对照组与缬沙坦组静脉移植物中膜厚度、中膜面积差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
2.3 Fas、FasL免疫组化染色切片计算机图像分析 Fas、FasL阳性表达的细胞表现为细胞膜和细胞浆呈棕黄色染色，主要集中在新生内膜。与对照组比较，缬沙坦组Fas、FasL的表达均增强（P<0.05）（表2，图2，3）。
3 讨 论
动脉旁路移植术后静脉移植物的再狭窄严重影响了手术疗效。目前认为，中膜SMC向内膜下移行、增殖及表型改变、分泌细胞外基质，是移植物再狭窄的主要病理基础。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与AT1结合，在移植静脉再狭窄过程中发挥重要作用。本研究中，缬沙坦组内膜厚度减少61.55%，内膜面积减少48.28%，组间差异具有统计学意义(P<0.01)。而两组静脉移植物中膜厚度中膜面积差异无统计学意义(P>0.05)。表明自体静脉移植术后，移植物内膜增生是移植物失效的主要原因。使用AT1受体拮抗剂在受体水平阻止AngⅡ与受体的结合，阻断不同来源的AngⅡ效应，能有效减轻血管内膜的增生。
在血管内膜增生过程中，血管平滑肌细胞（VSMC）存在明显的凋亡现象，在一定程度上减轻了再狭窄病变，Fas、FasL系统是移植血管再狭窄过程中的主要凋亡途径。Fas又称Apo-1或CD95，是调节细胞凋亡的Ⅰ型跨膜糖受体，在多种组织和细胞均有表达，具有325个氨基酸，相对分子质量45kDa，属于肿瘤坏死因子和神经生长因子受体家族。Fas配体是细胞表面的Ⅱ型膜蛋白，具有218个氨基酸，相对分子质量为26 kDa，属于肿瘤坏死因子亚家族。Fas与FasL结合后，向表达Fas的细胞传递死亡信号，引起细胞凋亡。实验证明，对经腺病毒预先免疫的动物感染可控的腺病毒或Adp21，会导致强烈的T细胞移行至血管壁，而用含有FasL腺病毒基因有效转染则抑制T细胞激活，从而减少损伤后血管新生内膜的形成[2]。很多体内体外实验也证实了VSMC对FasL介导的细胞凋亡的易感性，体外培养的VSMC在编码FasL的复制缺陷腺病毒载体感染后出现凋亡，腺病毒编码FasL转染球囊损伤的大鼠颈动脉后局部表达，可以诱导增生的SMC产生凋亡进而有效抑制新生内膜的增厚[3]。
本试验中缬沙坦组Fas及FasL的表达均较对照组增加（P<0.05），表明缬沙坦可促进新生内膜表达Fas及FasL，从而促进细胞凋亡，抑制新生内膜增厚、减轻移植静脉的再狭窄。杨彬等[4]将洛沙坦应用于大鼠动脉损伤模型，证实可以促进Fas、FasL在VSMC的表达，减轻血管损伤后的增生性重塑。梁绪国等[5]采用洛沙坦对体外培养VSMC凋亡及相关基因进行研究，发现洛沙坦增强Fas表达，抑制Bcl-2表达，促进VSMC的凋亡。我们将缬沙坦应用于兔颈部自体静脉移植模型，研究结果与上述实验相符。缬沙坦能抑制移植静脉内膜增生其机制可能与促进Fas、FasL表达，进而促进VSMC凋亡有关。
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[1] Walsh K, Smith RC, Kim HS. Vascular cell apoptosis in remodeling, restenosis, and plaque rupture[J]. Circ Res, 2000, 87(3):184-188.
[2] Luo Z, Sata M, Nguyen T, et al. Adenovirus-mediated delivery of fas ligand inhibits intimal hyperplasia after balloon injury in immunologically primed animals[J]. Circulation, 1999, 99（14）:1776-1779
[3] Sata M, Suharra T, Walsh K. Vascular endothelial cells and smooth muscle cells differ in their expression of Fas and Fas ligand and in their expression of Fas ligand and in their sensitivity to Fas ligand-induced cell death: implications for vascular disease and therapy[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2000,20（2）: 309-3l6
[4] 杨 彬, 成 蓓, 刘成云. 氯沙坦在损伤血管重构中的作用及其机制的探讨[J].心脏杂志， 2004，16(1):23-28.
[5] 梁绪国, 刘泳新. 洛沙坦对血管紧张素Ⅱ所致血管平滑肌细胞凋亡及凋亡调控基因的影响[J]. 山东大学学报(医学版)， 2005, 43(6): 492-495.
