AIDS的实验诊断
【关键词】 获得性免疫缺陷综合征；人类免疫缺陷病毒；实验室技术和方法
获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome）又称艾滋病（AIDS），已成为危害全球的一种严重传染性疾病，是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）引起的。艾滋病在我国的流行已经进入快速增长期，预防和控制艾滋病已经刻不容缓［1］。因此对HIV抗原抗体的检测，尽早发现感染者控制其传播是非常重要的。目前临床检测内容主要有P24抗原、HIV抗体、HIV病毒载量和CD4+T淋巴细胞计数等。现就HIV的实验诊断方法作如下简述。
1 HIV的结构特点
HIV呈球形或卵形，直径90～130nm，包膜由病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成。其核心含有两条相同拷贝的RNA链，其外周是由多种蛋白质形成的核膜。HIV同其它逆转录病毒一样，基因组中存在三个大的开放读框，其顺序是gag-pol-env。Gag基因编码55KD的前体蛋白，在病毒成熟过程中，被pol基因编码的蛋白酶加工，分别产生核心蛋白P17、核壳蛋白P24和核酸结合蛋白P15。P24是核壳组成蛋白，构成病毒的核衣壳，它的结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。在HIV-2与P24对应的是主要核心抗原P32，为HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白，由外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41组成（在HIV-2型病毒中与之相当的是gp110/130和gp36）［2］。
2 HIV抗原检测
在感染早期，HIV抗体尚未出现，而血Ｐ24抗原常以低水平出现，因此检测P24抗原可作为早期特异性诊断；该抗原检出率远比HIV抗体为低，因为HIV抗原出现不久即可产生抗体，抗原抗体以复合物形式存在，而游离很少，抗原在感染后期再度升高作为HIV活动性感染的标志。因此，P24抗原检测主要作为HIV抗体检测“窗口期”的诊断，同时对监测病程进展和预后判断、判定新生儿感染母婴垂直传播可能性、疗效评价、评价新疫苗、艾滋病的研究等方面有重要意义［3］。
P24抗原检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫（RIA）、免疫荧光技术（IFA）、免疫吸附电镜（ISEM）等，其中ELISA最为敏感。其原理是用已知抗体包被固相载体，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与抗体结合形成复合物，再加入酶标记抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪读取结果。此法易受干扰物质影响产生假阳性，因此需用综合实验加以鉴别。由于HIV感染早期P24抗原量很少且病情过程中抗原抗体形成复合物阻碍P24抗原检出，另外，方法灵敏度不高也影响检出率。
新技术的应用，提高了P24抗原检出率，主要有：①免疫复合物裂解检测法（ICD），利用弱酸可使免疫复合物解离，增加P24抗原浓度，从而提高阳性检出率，其敏感性90%［4］。但不宜单独使用，可用于细胞培养中HIV测定，抗HIV药物疗效测定，或急性HIV感染检测时替代HIV-RNA检测。②超敏感酶免疫测定法（UEI），又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定，基本原理是利用高亲和力抗体浓缩富集Ｐ24抗原进行检测。此法对试剂仪器要求较高，操作复杂。③ISEM，将抗原抗体的特异性与显微镜的高分辨率相结合，对病毒颗粒直接特异性检测。此法灵敏度高，需精密仪器，操作复杂。④线性免疫酶测定（LIA）和Cobas core HIV Combi EIA属新近发展起来的第四代HIV检测技术［5］。
3 HIV抗体检测
3.1 ELISA ELISA作为HIV抗体初筛最常用的检测方法，其实验用试剂在经历了第1代、第2代、第3代后，已经发展到第4代［6，7］。1985年美国FDA批准使用的第1代ELISA检测试剂，主要是以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，由于含有宿主细胞成分的污染和杂蛋白的存在，故假阳性率较高。1990年第2代试剂使用了基因工程的重组或人工合成多肽HIV抗原包被反应板，抗原组成一般包括P24、gp36、gp41、gp120能同时检测HIV-1、HIV-2型，其特异性较第1代试剂有了很大的提高。1992年美国研制出第3代试剂，使用双抗原夹心法检测抗体，相对第2代试剂敏感性有所提高，由于其检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型，并且同时能检出IgM抗体，因此窗口期由10周可以缩短至3～4周。为避免窗口期传染，荷兰、法国等国已研制出第4代试剂，于1998年在欧洲注册使用。它是在第３代的基础上进一步增加了P24抗原的检测。同时进行HIV抗体及P24抗原的检测，可以提高试剂敏感性，缩短窗口期，一般为4～14天左右，减少急性感染者窗口期漏检［8］。据报道［9］，由于急性ＨＩＶ病人病程中存在从血清Ｐ24抗原降低到抗体升高的“第2窗口期”，此时抗原抗体浓度均低于试剂检测限，结果为阴性。因此应选择敏感的的检测试剂，避免“第2窗口期”。另据报道［10］，第4代试剂虽然缩短窗口期，但其特异性却比第三代略低。因此还要进一步提高敏感度。
3.2 明胶颗粒凝集实验（gelation particle agglutination assay，PA） 它是通过包被了HIV抗原的颗粒凝聚来检测HIV抗体，用明胶制成的颗粒作为载体，加入预先稀释的样本，经抗原致敏的明胶颗粒作实验孔，未致敏的明胶颗粒作阴性对照孔，样本中有抗HIV存在时，可与抗原致敏的颗粒发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝聚情况判读结果。PA是一种快速、简便的筛查实验，很适合对少量标本的检测，其灵敏度和准确性不如ELISA法。
3.3 金标快速反应试验 它将颗粒凝聚法的简便性和酶免疫测定（ＥＩＡ）技术相结合，用于快速检测抗-ＨＩＶ。一般采用醋酸纤维素膜作固相载体，用红色胶体金A蛋白取代酶标抗体，在载体下面有吸水衬垫可吸收加入的待检样本溶液。将重组或合成HIV肽抗原包被在载体上，加入待检血清，包被抗原和被检血清中抗体结合，样本中有抗-HIV时，则薄膜上就会产生一橘红色斑点（或线条），一般3～10min出结果，特异性较好，试剂稳定，检测时不需要任何设备，快速简便，适用于应急检测以及边远地区检测。
3.4 免疫印迹试验（western blot，WB） WB被称为抗-HIV检测的“金标准”，它的原理是将HIV病毒蛋白通过十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的蛋白带分离开来，再把这些已经分离的不同蛋白转移到醋酸纤维素膜上，再将此膜切割成条状，每一条醋酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。待检血清样本用稀释液稀释成1∶100，把它直接加到醋酸纤维素膜上，恒温振荡，使其充分接触反应。血清中若含有抗-HIV，就会与膜条上的抗原结合，冲洗除去多余的抗体，再加入抗人-IgG酶结合物并孵育，经洗涤后加入底物，有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果。据文献报道［3］WB特异性为97.8%。
3.5 其他方法 艾滋病唾液检测卡（萨丽卡，salivacard）、家庭HIV检测（homeaccess system）、尿液HIV抗体检测。
4 HIV病毒载量检测
HIV病毒载量是指体内病毒复制的数量，一般以血清HIV-RNA表示， 随着生物技术的，HIV病毒载量检测得到人们越来越多的重视，它可以直接检测HIV-RNA，可在发现血清学变化之前检测HIV感染，而且比Ｐ24抗原检测方法更灵敏，主要以ＲＮＡ的拷贝数表示。其检测意义在于：①早期辅助诊断：可在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸使窗口期缩短6～11.5天。也可判定无症状，而血清阴性患者潜在的HIV传染性；②用于预测疾病病程和监测抗病毒的疗效与病毒水平；③用PCR检测HIV-RNA可判定婴儿出生后18个月内，他们血液中的HIV-IgG抗体是否为来自于母体的HIV-IgG抗体，婴儿是否被感染上HIV［11］。
4.1 PCR检测法（聚合酶链反应） PCR技术基于对RNA逆转录酶的作用，使病毒RNA逆转录为CDNA，随后进行多聚酶链反应，扩增DNA片段，使其达到可检测的含量。传统的PCR技术比较简便、快捷，但是容易出现假阳性，另外，HIV基因多样性，没有一套引物可覆盖所有HIV序列，使检测敏感性受到限制。从而限制了PCR临床诊断HIV以及用于高危新生儿感染检测。
实时荧光定量PCR技术虽在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，特异性更强，有效地解决了PCR“污染”问题，自动化程度高等特点，目前得到广泛应用。该方法可以检测血浆病毒载量，也可以检测血液中单个核细胞的前病毒载量。一般来说，前病毒载量与血浆病毒载量平行，具有相关性［12］。
4.2 分枝ＤＮＡ信号扩增检测法（bDNA） 该方法是通过将捕捉到的病毒基因信号扩增直接检测RNA，即从HIV中提取分离RNA，与靶探针杂交抽取RNA，再通过另一部分靶探针使支链DNA分子与RNA结合，利用化学发光原理进行扩增信号，发光强度与HIV-RNA含量呈比例关系。bDNA可测出单个拷贝的HIV，实际灵敏度可测出约每毫升10000个HIV，其改良方法可达每毫升500个HIV左右。耗时较长，约20ｈ且过夜，bDNA不存在扩增物的交叉污染。可以检出所有亚型，敏感度稍低［13］。
4.3 核酸序列扩增实验（NASBA） NASBA又称自主序列复制系列（3SR）或再生长序列复制技术，是以RT-PCR为基础，但它无需将逆转录和ＰＣＲ扩增分两步进行，它是一个扩增的酶系统，包括RT酶、RNaseH和T7RNA聚合酶模拟病毒RNA在细胞内复制过程，产生大量拷贝的ＲＮＡ片段，现在证明NASBA是在HIV感染早期阶段对血液中HIV-1病毒检测的非常灵敏的方法。如果将NASBA与荧光相关光谱FCS连用还可以对HIV-1RNA进行在线检测。这是预测病情变化和监测抗病毒疗效非常重要的指标。
5 基因芯片技术
HIV基因芯片技术是把PCR技术和核酸分子杂交技术完美结合。是在厘米见方的固相载体上，将基因以微点阵的形式排列，应用核酸杂交的原理来检测未知基因，具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点［14］。1996年底，Kozal等研制出一种DNA芯片，对HIV-1逆转录酶及蛋白酶的基因突变进行筛选，并跟踪监测HIV拮抗药物的产生和突变，疾病相关基因型以及监控患者在治疗中的反应。1998年Hauser等应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测HIV，对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。HIVPRT440也已广泛用于HIV-1病毒的测序、分型及多态性分析［15］。因此，基因芯片在鉴定HIV感染实验诊断中具有广泛的应用前景。
6 CD4+T淋巴细胞计数
CD4+T淋巴细胞是人体免疫系统最重要的细胞之一，HIV主要侵犯CD4+淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤。而CD4+淋巴细胞其辅助功能不仅可以促进CTL的激活，而且也引起Ｂ细胞的抗体分泌［16］，所以，HIV感染者的病程进展速度与CD4+细胞计数的下降程度密切相关。CD4+淋巴细胞计数是AIDS诊断，疾病分期，制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的实验室标准指标。目前对CD4+淋巴细胞计数有手工操作法和自动检测法，手工检测常用荧光标记的特异性抗CD4+细胞单克隆抗体检测。流式细胞仪是目前最好的自动检测方法，可得出CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的绝对值及占淋巴细胞的百分率。
7 病毒分离培养
人体感染病毒后，便会终生携带。HIV广泛存在于人体的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织、血液和其他体液中，从这些材料中分离培养HIV，可用于HIV感染的辅助诊断，以及研究HIV在人群中的分布、变异和耐药情况。HIV病毒分离需要在P3级生物安全实验室进行，实验条件要求高。
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