对赤芍醇提浸膏和水提液治疗胆汁淤积型肝损伤的药效筛选

           作者：罗琳，姚敏，韩萍，窦志华，徐济良

【摘要】  目的：筛选有胆汁淤积型肝损伤作用的赤芍提取物。方法：将小鼠随机分成正常对照组、模型组、赤芍醇提浸膏高、中、低剂量组，水提液高、中、低剂量组和阳性药赤丹退黄颗粒组；用α－萘异硫氰酸酯建立胆汁淤积型小鼠模型，连续给药6天后，检测血清ALT、BIL、ALP、TBA等指标，并进行病理组织观察和半定量分析。结果：赤芍醇提浸膏能显著降低血清DBIL、ALP、ALT和AST值（P<0.05或P<0.01），并能明显改善α－萘异硫氰酸酯引起的组织损伤（P<0.01），中剂量作用与阳性对照药相似；而水提液没有治疗作用（P>0.05）。结论：赤芍治疗胆汁淤积型肝炎的有效药物成分主要在赤芍醇提浸膏中。

【关键词】  肝损伤；胆汁淤积；赤芍；α-萘异硫氰酸酯；小鼠

    [Abstract]   Objective: To screen the effective extract of Radix Paeoniae Rubra on cholestatic hepatic injury. Methods: All mice were randomly divided into nine groups : the control group, the model group, the extracta sicca groups of high dose, medium dose and low dose, the water extract groups of high dose, medium dose and low dose, and the Chidan granula group. The cholestatic hepatic injury animal models were made by alpha-naphthylisothiocyanate（ANIT）. All animals were given the drugs or normal saline for six days. The serum indexes of ALT, BIL, ALP, TBA were tested and the pathological changes of the livers were analyzed by semiquantitative method. Results: The extracta sicca decreased the levels of DBIL, ALP, ALT and AST in serum (P<0.05 or P<0.01), and it also significantly improved the liver injury induced by ANIT (P<0.01). The extracta sicca group of medium dose had the same effect as the Chidan granula group.There was no effect in the water extract groups (P>0.05). Conclusion: The pharmacodynamic ingredients healing cholestatic hepatic injury are in the extracta sicca of Radix Paeoniae Rubra.

    [Keywords]   Hepatic injury; Cholestasis; Radix Paeoniae Rubra; Alpha-naphthylisothiocyanate; Mouse

    赤芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflom Pall）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）干燥根。其味苦，微寒，归肝经，具有清热凉血，散瘀止痛之功能[1]。大量的临床和实验研究表明，赤芍治疗黄疸型肝炎疗效确切[2，3]，但迄今为止对其研究仅停留在单味药或复方层次，而其治疗黄疸型肝炎的药效物质成分并不清楚。

    赤芍总苷是赤芍的主要活性成分，但其是否为赤芍治疗黄疸型肝炎的活性成分尚有待研究证实[4]。鉴于此，本课题先对赤芍的水提部位和醇提部位进行退黄降酶药效的筛选，为进一步提取分离确切的药效部位奠定基础。

    1   材料与方法

    1.1   实验动物   健康ICR小鼠，雌雄各半，体重20±2 g，由南通大学动物实验中心提供, 动物使用许可证：SYXK(苏)2007-0021。

    1.2   药物   （1）α－萘异硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyanate，ANIT），由Sigma公司生产，批号：18320LD；（2）赤丹退黄颗粒，由长沙九芝堂股份有限公司生产，批号：20061206；（3） 赤芍浸膏：赤芍经75％乙醇回流提取后得醇提液部分，该醇提液部分再回收乙醇后即为赤芍浸膏。经该方法处理后，每克浸膏含药材3.07675 g；（4） 赤芍水提液：赤芍经75％乙醇回流提取后得药渣部分，加水煎煮，弃去药渣，将所得药液浓缩即为赤芍水提液；经该方法处理后，每毫升水提液相当于药材约1.5 g。

    1.3   实验方法   将108只小鼠随机分成9组。A组：正常对照组，B组：模型对照组，C组：浸膏低剂量组，D组：浸膏中剂量组，E组：浸膏高剂量组，F组：水提液低剂量组，G组：水提液中剂量组，H组：水提液高剂量组，I组：阳性药物对照组（赤丹退黄颗粒组）；每组均为12只小鼠，雌雄各半。给药剂量：赤芍浸膏和水提液低、中、高剂量组分别为：5.2 g·kg-1·d-1、15.6 g·kg-1·d-1、46.8 g·kg-1·d-1。阳性药根据成人剂量折算成小鼠为3.9g·kg-1·d-1。在实验的第1天及第4天，除正常对照组外，其余各组动物均按80 mg·kg-1的剂量给予ANIT油溶液灌胃造模，容量为0.1 ml·10g-1·d-1。

    实验第1和第4天，C～I组于造模1 h后分别灌胃给予相应治疗药物：赤芍浸膏或水提液，容量均为0.2 ml·10g-1·d-1，实验其他各天均只直接给予相应剂量治疗药物，模型组及正常组均给予相应容量的0.5％ CMC-Na。实验第6天，所有动物先禁食12 h，于末次给药1 h后，断头取血，2000 r/min离心10 min，取血清，检测总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转移酶（GGT）、总胆汁酸（TBA）等指标。同时每组随机取6只动物的左叶肝脏组织，10％甲醛固定，常规HE染色，光镜观察肝组织病理变化，并根据病理分析赋值标准进行半定量分析（表1）。

    1.4   统计学方法   数据以x±s表示，使用Stata7.0统计软件包进行统计处理，样本数据比较采用单因素方差分析和HSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

    2   结      果

    2.1   实验小鼠一般情况观察   造模前，小鼠的一般情况佳，尿液为浅黄色；造模后，除正常组外，其余各组小鼠的活动度明显下降，饮水、进食明显减少，毛色缺乏光泽，尿液为深黄色，浸膏中剂量组和赤丹退黄颗粒组小鼠一般状况较模型组稍好，尿色较模型组略淡。

    2.2   各组小鼠的血清指标结果   见表2。浸膏治疗6天后与模型组相比，各剂量组的TBIL、IBIL和TBA虽有一些下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；但高剂量组ALT虽有降低趋势却并无明显差异（P＞0.05）；水提液治疗组与模型组相比，各剂量组的BIL、ALP 、TBA 、ALT及AST均无明显改善（P＞0.05）。

    2.3   各组小鼠的肝脏组织结构及半定量分析结果   光镜下可见（图1）A：肝小叶结构及肝细胞形态正常，肝窦无扩张，毛细胆管无淤胆，汇管区未见炎性细胞浸润； B：肝小叶可见较多坏死灶，肝细胞明显变性且排列紊乱，肝窦有显著扩张，毛细胆管淤胆明显。汇管区有大片炎症细胞浸润；血管扩张瘀血，胆管明显增生且胆管上皮细胞水肿，变性，易见固缩坏死；D：肝小叶结构存在，细胞排列较整齐，肝细胞可见肿胀，无明显坏死灶，毛细胆管淤胆不明显，汇管区炎细胞浸润明显减轻，血管扩张瘀血及胆管上皮增生不明显，该组病变程度明显轻于浸膏低剂量和高剂量组，与阳性药组接近；G：肝小叶可见明显坏死灶，肝细胞有肿胀，肝窦扩张，毛细胆管可见淤胆。汇管区有大量炎细胞浸润；胆管明显增生且胆管上皮细胞水肿，空泡变性多见；水提液各剂量组间病变程度相近，且与模型组相比病变没有明显改善。I组肝小叶结构存在，可见少量坏死灶，部分肝细胞呈气球样变，部分汇管区可见炎细胞浸润，同时也可见少量结缔组织增生，血管扩张淤血及淤胆较模型组明显减轻。

    半定量分析结果显示见表3。中剂量组病变程度与阳性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），水提液各剂量组与模型组相比改变差异无统计学意义（P>0.05）。

    3   讨      论

    ANIT是一种肝毒剂，对肝脏的损害主要是引起小叶间胆管周围产生炎症，胆管阻塞、形成明显的胆汁淤积，并伴以点状坏死为主的肝实质细胞损害[5]。本实验中小鼠造模后，模型组血清指标较正常对照组均有明显升高，这说明肝内胆汁淤积性小鼠黄疸模型的制备是成功的。

    浸膏各组能明显降低DBIL、AST和ALT，改善肝脏组织损伤，具有一定的降酶退黄的保肝作用（P<0.05）；而水提液各组对实验中各项血清学指标及病理组织均无明显改善作用（P>0.05）。所以，浸膏的降酶退黄作用明显优于水提液。同时，与阳性药物赤丹退黄颗粒相比，尤其是浸膏中剂量组在降低ALT、AST方面要略优于赤丹退黄颗粒（P<0.01或P<0.05），而退黄方面的作用与其相近（P>0.05）。该结果提示赤芍治疗胆汁淤积型肝炎的有效药物成分主要在醇提浸膏中。

    此外，浸膏治疗组剂量依赖性不明显，尤其高剂量组的有些血清指标甚至较中剂量组有升高，可能是由于浸膏高剂量组药物较稠影响吸收，药效受到了影响。因此，进一步提取浸膏中具有降酶退黄的确切药效成分，并开发出能充分发挥其作用的相关药物是十分必要的。

【】
  [1] 阮金兰，赵钟祥，曾庆忠，等. 赤芍化学成分和药理作用的研究进展[J]. 药通报，2003，19（9）：965-970.

[2] 王良骏. 重用赤芍治疗肝病之近况[J]. 中西医结合肝病杂志，2002,12（4）：255-256.

[3] 王春平，张玉健. 凉血化瘀法重用赤芍治疗瘀胆型肝炎36例[J].中国中西医结合消化杂志，2004,12(6):370-371.

[4] 袁冬生，周兰芳，石 磊. 赤芍总苷对D-氨基半乳糖胺所致小鼠肝损伤的保护作用[J]. 热带医学杂志，2007，7（2）：139-142.

[5] 黄志华，黄 欣，李 艳． 实验性急性肝内胆汁淤积肿瘤坏死因子和白细胞介素-6动态变化及意义[J]． 中华肝胆病杂志，2003，11（5）：313-314.