慢病毒绿色荧光蛋白感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率观察
【摘要】 目的：观察慢病毒-绿色荧光蛋白（Lentivirus-green fluorescent proteins，慢病毒-GFP）感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率，为后继的利用慢病毒载体来介导RNA干扰（RNA interference，RNAi）实验作准备。方法：应用慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞，在感染后不同的时间段在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况并感染效率。结果：慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞从60~72小时开始可见明显的绿色荧光，在感染复数（multiplicity of infection, MOI）=10时，CFPAC-1细胞的慢病毒感染效率在60小时左右可达80％以上，72小时~7天基本能够达到90％的感染效率，在此后4周内作连续观察，感染效率仍维持在80％~90％。结论：慢病毒可稳定感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1，且效率高，可作为载体对该细胞株进行RNAi实验。
【关键词】 慢病毒；胰腺癌细胞，CFPAC-1；绿色荧光蛋白
[Abstract] Objective：To observe the infection efficiency on CFPAC-1, one cell line of human pancreatic cancer, after application of the lentivirus-GFP. Then making preparations for the following experiments about RNA Interference（RNAi）. Methods：Application the lentivirus-GFP infection CFPAC-1, at different periods after infection, we observed the expression of green fluorescent proteins(GFP) and then calculated the infection efficiency. Results：In the period of 60~72 h after lentivirus- GFP infection CFPAC-1, we observed conspicuous green fluorescence. When the multiplicity of infection(MOI) was 10, the infection efficiency of lentivirus-GFP was above 80％ after infection 60 h around; In the period of 72 h~7 d, the infection efficiency basicly meeted 90％. After following 4 weeks continuous observation, we found the infection efficiency still keeping in the range of 80％~90％. Conclusions：Lentivirus can steadily infect CFPAC-1 and the infection efficiency is considerable high, we can use it as the vector to do some RNAi experiments on the cell line of CFPAC-1.
[Key words] Lentivirus; Pancreatic cancer cell; CFPAC-1; Green fluorescent protein
我们既往研究表明，人胰腺癌细胞株CFPAC-1高表达增殖诱导配体（APRIL）基因[1]，我们欲进一步采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）试验来研究该基因在胰腺癌的发生、中的内在机制。然而, 未见国内外有关CFPAC-1细胞株转染效率的报道。因此，我们先预实验观察慢病毒-绿色荧光蛋白（Lentivirus-green fluorescent proteins，慢病毒-GFP）感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1的效率，为后继的利用慢病毒载体进行RNAi实验奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料 人胰腺癌细胞株CFPAC-1（中科院上海生科院细胞资源中心）；慢病毒-GFP、293T细胞株、HBSS (Hank’s balanced salts solution) 液（上海吉凯公司）；RPMI-1640培养基（美国Invitrogen公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；DMI 4000B倒置荧光显微镜（Leica公司）。
1．2 细胞培养 分别用含10％胎牛血清的完全培养基单层培养CFPAC-1、293T细胞于37℃、5％CO2饱和湿度恒温孵育箱内，以0.25％胰酶消化传代。
1．3 慢病毒感染CFPAC-1及293T细胞 实验前1天接种1×105个CFPAC-1及293T（对照细胞）于24 孔培养板中，所加完培体积为400 μl，待细胞融合约50％~60％时进行病毒感染。取-70℃保存的病毒在冰上融化，无菌操作，在目的细胞和对照细胞中分别加入50 μl HBSS液稀释好的病毒，培养液总体积为500 μl,混匀后置37℃培养。如慢病毒对细胞有明显毒性作用，在感染8~12小时后，更换新鲜完培（800 μl/well）后继续培养；如慢病毒对细胞没有明显毒性作用，4~6 小时后可补加入300 μl 完培继续培养。由于病毒载体上带有GFP绿色荧光蛋白，可以在病毒感染48~72 小时及随后4周用倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。
1．4 确定最适的感染复数（multiplicity of infection, MOI）值 将生长状态良好的CFPAC-1及293T细胞接种到96孔板, 每孔中加1×105个细胞, 按病毒与细胞的比例(MOI值=1、5、10、50和100)进行实验, 培养8 h后, 更换10%血清的培养液继续培养, 加入病毒3~4天后通过荧光显微镜观察阳性细胞比例，计算细胞感染效率在80%以上时需要的病毒量来确定最适感染MOI值。
2 结 果
慢病毒-GFP感染CFPAC-1及293T细胞效率观察：慢病毒-GFP感染CFPAC-1细胞从60~72小时开始可见明显的绿色荧光，在MOI（感染复数）=10时，CFPAC-1细胞的慢病毒感染效率（GFP阳性率）在60小时达80％以上，72小时~7天基本能够达到90％，在此后的4周内作连续观察，荧光细胞数并未下降，感染效率仍维持在80％~90％。经同样处理的293T对照细胞在MOI＝5时各时间段的感染效率也在80％左右，见图1。由图可知，慢病毒感染CFPAC-1细胞效率高，且能长期稳定感染。
3 讨 论
目前，质粒载体介导的RNAi试验已广泛应用于生命相关研究领域，由于无法保证高基因转染效率，故稳定转染细胞株的筛选也变得很不确定，尤其是那些转染效率极低的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，即使采用抗性筛选也异常艰难，这个瓶颈极大的限制了RNAi相关的研究。
而慢病毒属逆转录病毒家族, 为非致癌性病毒，常作为基因载体。其特点是能感染非分裂期细胞和分裂期细胞, 为潜伏期长、持续时间长的慢性感染[2]。现阶段慢病毒表达系统包括3个主要部分：慢病毒表达载体、慢病毒包装质粒、产生假病毒颗粒的细胞株（如293T细胞）；即该系统中包括包装、转染、稳定整合到基因组DNA和表达siRNA、cDNA或报告基因等过程所需要的遗传信息。对于多种细胞，通过慢病毒介导的方法可实现几乎100％的转染效率，稳定转染细胞株筛选的成功性也大大增加[3,4]。
利用慢病毒构建的短发夹RNA（small hairpin RNA, shRNA）载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比， lentivirus-shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，且在感染后可整合到受感染细胞基因组，进行长时间的稳定表达。尤其是慢病毒感染用于活体实验时，并不会像其他化学转染一样引起非特异性反应，因而适用于在体RNAi的研究，包括稳定表达细胞株成瘤实验、瘤内注射、局部注射等, 这就为在患者体细胞中实现针对致病基因的RNAi提供了可能[5~7]。
【】
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