大鼠皮质脊髓束Luxol Fast Blue染色

              作者：吕广明，吴辉群，栗卓，刘苏，韩笑，季达峰

【摘要】  目的：探讨显示大鼠皮质脊髓束的特殊染色方法。方法：选用正常成年SD大鼠延髓和脊髓冰冻切片，应用Luxol Fast Blue 染色法进行染色。结果：Luxol Fast Blue染色后，在延髓和脊髓切片中可见灰质呈淡红色，白质呈蓝色，延髓锥体染成深蓝色。锥体中Luxol Fast Blue标记的深蓝色阳性纤维，经锥体交叉后至脊髓灰质后连合背侧，沿脊髓后索腹侧深层下行，至荐段后逐渐消失。在延髓锥体和脊髓颈、胸、腰段后索中，深蓝色的Luxol Fast Blue阳性纤维边界清晰，与周围结构区分明显。结论：运用Luxol Fast Blue 染色可清楚显示大鼠皮质脊髓束在脊髓内的定位，是一种简便可靠的皮质脊髓束形态学研究方法。

【关键词】  皮质脊髓束；Luxol Fast Blue；髓鞘染色；大鼠

    [Abstract]   Objective: To explore the special staining method for revealing the localization of corticospinal tract in rats. Methods: Luxol Fast Blue staining method was utilized to stain the sections of medulla oblongta and spinal cord of the normal adult Sprague-Dawley rats. Results: In Luxol Fast Blue staining sections, the gray matter of medulla oblongta and spinal cord was stained in light red, while the white matter around the gray matter was dyed in blue. The dark blue stained Luxol Fast Blue labeled fibers in the pyramid passed through the pyramidal decussation to the contralateral side, descended at the ventral part of posterior funiculus just dorsal to the gray commissure throughout most of the length of the spinal cord and progressively diminished to end at the sacral spinal segments. The Luxol Fast Blue positive fibers in the pyramid and the ventral part of posterior funiculus at cervical, thoracic, lumbar spinal segments were easily discriminated from the surrounding structures. Conclusion: Using Luxol Fast Blue staining method may demonstrate the localization and distribution of corticospinal tract in the spinal cord of rats, which is an easy and effective method in morphological study of corticospinal tract.

    [Key Words]   Corticospinal tract；Luxol Fast Blue；Myelin stain；Rat

    长期以来，脊髓损伤后皮质脊髓束的再生修复研究一直是神经研究的热点。最近有人尝试运用微芯片技术重建皮质脊髓束功能[1]。此项研究中一个关键指标就是皮质脊髓束在脊髓内定位和走行情况。常用的组织学染色方法不能显示皮质脊髓束，本实验采用Luxol Fast Blue染色法对大鼠皮质脊髓束进行形态学研究，取得良好效果。

    1   材料和方法

    1.1   材料   选用健康成年SD大鼠6只，清洁级，体重250~300g,雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。0.1 % Luxol Fast Blue液（Sigma公司），Leica CM1900冰冻切片机，显微镜为Leica DMR显微镜（Leica公司，德国）。

    1.2   方法   切片制备：给予大鼠复合麻醉剂（0.2 ml/100g体重），腹腔注射麻醉后开胸，穿心脏经升主动脉灌注，先用温（37℃）生理盐水200 ml冲净血液，再用预冷（4℃）的含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液500 ml快速灌注固定，1 h后取脑和脊髓放入含4%多聚甲醛的PB溶液中后固定4~6 h,再移入30%蔗糖的PB溶液中4℃过夜，待组织沉底后取脑（延髓）和脊髓颈、胸、腰、荐段行连续横切面冰冻切片，切片厚度为30 μm，直接贴于预先涂有明胶的载玻片上，置室温下晾干待用。

    Luxol Fast Blue 染色：（1）将切片放入乙醇∶氯仿溶液（无水乙醇和氯仿的体积比为1∶1）中5 min；（2）将切片置入 95%乙醇溶液中5 min；（3） 0.1 % Luxol Fast Blue液中56℃过夜；（4） 95%乙醇溶液5 min；（5） 70%乙醇溶液3 min；（6）双蒸水3 min；（7）0.05%碳酸锂溶液分化5 min， 70%乙醇溶液继续分化30 s；（8） 双蒸水洗片；（9） 镜下观察脊髓灰、白质分界是否清晰，若分界不清晰，则需重复（6）、（7）两步骤，直至分化清晰为止；（10） 70%乙醇溶液3 min；（11） 0.5%伊红溶液1 min；（12） 双蒸水洗片；（13） 0.1%焦油紫溶液复染30 s；（14）双蒸水洗片；（15） 70%乙醇溶液3 min；（16） 95%乙醇溶液5 min；（17）常规脱水透明、中性树胶封片。Leica DMR显微镜下观察并摄影。

    2   结      果

    切片经Luxol Fast Blue染色后，在延髓和脊髓切片中可见灰质几乎不着色，白质呈蓝色，境界清晰（图1），延髓锥体染成深蓝色，与周围结构区分明显（图1A），随后锥体中Luxol Fast Blue标记的深蓝色阳性纤维，经锥体交叉（图1B）后至脊髓灰质后连合背侧，沿脊髓后索腹侧深层下行，在脊髓颈、胸、腰段后索中，深蓝色的Luxol Fast Blue阳性纤维边界清晰（图1C、D、E），至脊髓荐段后逐渐消失（图1F）。

    3   讨      论

    髓鞘染色方法有多种，基于不同的原理，可利用媒染剂、油溶性染料或锇酸与类脂质的特殊反应。常用的有经典Well染色法、经典碳酸锂苏木精染色法、固绿染色法、银染法等。经典Well染色法操作简单，试剂价格低廉，是显示神经纤维髓鞘的可靠而常用的染色方法，但染色结果对比度差、步骤多、分化难于掌握等[2]；经典碳酸锂苏木精染色法的主要缺陷是染色时间长、步骤繁琐、容易脱片，温度需要控制在50℃～55℃[3-4]；而锇酸价格昂贵，浸透性差，难以获得满意结果。栗卓等[5-6]采用丽春红染色法观察到大鼠脊髓白质以及皮质脊髓束在脊髓内定位分布情况，但此方法观察到的皮质脊髓束在脊髓颈胸段较清楚，自腰髓以下就不易辨认，无法显示完整的皮质脊髓束在脊髓内的定位和走行情况。

    为寻找更好且能显示完整皮质脊髓束的染色方法，本课题组尝试运用了Luxol Fast Blue染色法。Luxol Fast Blue（LFB,罗克沙尔坚牢蓝）属于铜-酞箐染料(copper-phthalocyanine dye)，在乙醇溶液内具有与髓鞘磷脂结合的染色特性，如再藉中性红或焦油紫复染，尚可显示神经元的胞核及尼氏体，且对髓鞘着色有一定的强化效应。Luxol Fast Blue染色后髓鞘着色鲜明，且有一定的特异性，是鉴定神经髓鞘的特异性比较好的标记物，可以用于显示髓鞘含量丰富的神经传导束，例如皮质脊髓束[7]。皮质脊髓束有大部分的有髓纤维和部分无髓纤维组成，髓鞘是有髓神经纤维的重要组成部分，其干重中有30%为蛋白质，70%为类脂质，两者结合成蛋白脂或脂蛋白。蛋白脂易溶于有机溶剂，如未经特殊处理将在组织制片过程中丢失。脂蛋白不易溶于有机溶剂，可在制片过程中保留下来。本实验采用Luxol Fast Blue染色法对大鼠中枢神经系统皮质脊髓束进行了染色，结果显示完整的皮质脊髓束境界清晰，着色的皮质脊髓束在脊髓内的位置与Brown等（1971）报道一致。Song等[8]运用LFB染色法通过显示其髓鞘的途径而显示动物模型中神经瘤细胞的病改变，其实验结果清晰可靠。有不少学者运用LFB染色法观察Luxol Fast Blue染色阳性纤维的多少来分析脱髓鞘病变及髓鞘再生等有关髓鞘改变的情况[9-11]。

    我们的实验结果表明，Luxol Fast Blue染色是研究皮质脊髓束定位、髓鞘病变、损伤和再生修复形态学观察的有效方法，为微芯片技术重建皮质脊髓束功能实验研究提供了形态学基础。

【】
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