β1，4－半乳糖基转移酶I影响雪旺氏细胞增殖的机制
作者：肖锋，季玉红，沈爱国 严美娟 刘海鸥 孙琳琳
【摘要】 目的：探讨β1，4－半乳糖基转移酶I影响雪旺氏细胞增殖的机制。方法：将不同浓度的β-1,4-GalT-I表达质粒转染雪旺氏细胞，采用Western blot方法检测增殖相关信号分子cyclin D1、p16INK4以及p27Kip1的表达水平，Northern blot方法检测p19ARF的表达变化。结果：随着β-1,4-GalT-I在雪旺氏细胞中的表达增加，cyclin D1表达降低，而p16INK4a 和p19ARF呈现相反的变化；p27Kip1变化不明显。结论：β-1,4-GalT-I影响雪旺氏细胞增殖可能与cyclin D1、p16INK4a和p19ARF介导的信号传导途径有关。
【关键词】 β1，4－半乳糖基转移酶I；雪旺氏细胞；增殖；大鼠
雪旺氏细胞是周围神经系统的主要胶质细胞，在周围神经的发育与再生过程中起重要作用。已有研究发现转染β-1,4-GalT-I后引起雪旺氏细胞增殖抑制，并且导致细胞周期阻滞在G1/G0期[2]。本实验通过检测调节细胞周期的相关信号分子，初步探讨β-1,4-GalT-I抑制雪旺氏细胞增殖的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 新生1～2 d SD大鼠60只，由南通大学动物中心提供。
1.1.2 实验试剂 培养板、胰蛋白酶、胶原酶、胶原、多聚赖氨酸(上海华美生物制品公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；forskolin、阿糖胞苷、IgM型抗Thy1.1、兔补体（美国Sigma公司）；抗p16INK4a、抗p27、抗cyclin D1单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；pcDNA3.1载体、LipofectawinTM2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；胶回收试剂盒（上海华舜公司）；PCR试剂盒（大连TaKaRa公司）； Prime-a-gene试剂盒（美国Promega公司），表达质粒pcDNA 3.1—β-1,4-GalT-I由复旦大学上海医学院基因研究中心惠赠。
1.2 方法
1.2.1 分离、纯化雪旺氏细胞 无菌条件下取出新生大鼠坐骨神经，用0.25％胰蛋白酶/0.03％胶原酶消化，先在含阿糖胞苷(Ara-C，5mmol／L)的培养液中培养48 h，洗净Ara-C 12h后，再进入含Ara-C培养液中培养24 h，而后在正常培养液中培养。成纤维细胞通过补体介导的细胞毒作用而消除，方法为：IgM型抗Thy1.1(1∶200)作用30min，洗净抗体后，用兔补体(1∶200)作用30min。以后细胞进入含Forskolin(2 μmol／L)的培养液中，每2～3d更换培养液1次。
1.2.2 Western blot 在分离、纯化的雪旺氏细胞转染正义β-1,4-GalT-I表达质粒和pcDNA 3.1空载体（5、10、20、40μg/孔，6孔板）3天后收取细胞蛋白。改良Lowry法进行蛋白定量后，经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。转膜后，以5%TBST脱脂奶粉封闭液室温封闭2h ，抗p16INK4a（1∶1000稀释），抗p27 (1∶1000稀释），抗cyclin D1（1∶1000稀释）4℃孵育过夜。相应HRP偶联的二抗（1∶2000稀释）室温孵育2h。洗涤后以ECL发光底物显影，分别显示p16INK4a、p27、 cyclin D1蛋白表达水平。GAPDH作为内参。
1.2.3 p19ARF和β-1,4-GalT-I DNA模板的制备 p19ARF引物 上游，5'-GTAATGCCACTGCTGGGAGA -3'；下游， 5'-ATGTGGCTGCGGCCCTCT- 3'。β-1,4-GalT-I引物：上游，5’-TTACTCECCAAGGACTGTG-3’；下游，5’-CTCTTGAAGCCGGATCATT-3’。
1.2.4 Northern blot的探针标记 根据试剂盒要求(Prime-a-gene)标记探针。
1.2.5 Northern blot分析 分别取β-1,4-GalT-I表达质粒和pcDNA 3.1载体不同转染浓度的雪旺氏细胞进行总 RNA 提取，40μg RNA上样，行甲醛变性胶电泳。转膜后，将膜用杂交液(含1.0mmol／L EDTA，1％BSA，7％SDS，15％甲酰胺) 65℃预杂交4h，加入变性的标记探针，65℃杂交16h。洗膜、压片、-70℃放射自显影，5～7d后，洗片。
2 结果
正常未转染和转染pcDNA 3.1空载体（5、40μg/孔）作为空白对照，将不同浓度的正义β-1,4-GalT-I表达质粒（5、10、20、40μg/孔），分别转染雪旺氏细胞，随质粒浓度的增加，雪旺氏细胞中β-1,4-GalT-I mRNA表达水平逐渐升高。当质粒浓度为5μg/孔时，cyclin D1蛋白质表达水平与正常无明显差异；随质粒浓度的升高，cyclin D1表达逐渐降低；p16INK4a蛋白质水平在质粒浓度为5μg/孔时即明显高于对照组，且质粒浓度增加时，仍保持同一高水平；p27Kip1变化不明显(图1)。p19ARFmRNA随着质粒浓度的升高，其表达水平逐渐升高，表现出一定的浓度依赖关系(图2)。
3 讨论
正常细胞的增殖、静止和衰老的发生，离不开细胞因子对细胞周期的精确调控。细胞周期素（cyclin）和细胞周期素依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）是组成真核细胞调控细胞周期中心控制体系中最为关键的两大基因家族。哺乳动物细胞从G1中期到后期的进程，依赖于cyclin D1介导的CDK4或CDK6的激活。cyclin D1在许多肿瘤的发生中发挥重要的作用。cyclin D1参与激活的Ras和Myc介导的肿瘤细胞的增殖[3]。上皮细胞和成纤维细胞在H-Ras诱导衰老后，出现cyclin D1的表达水平下降，伴随有对生长因子的需求下降和细胞G1期的阻滞[4]。由于β-1,4-GalT-I过表达也能引起雪旺氏细胞增殖抑制，并且导致细胞周期阻滞在G1/G0期，因此我们检测了cyclin D1表达水平，发现随β-1,4-GalT-I在雪旺氏细胞中的表达增高，cyclin D1表达降低。
CDK抑制分子（CDK inhibitors，CKIs）也是一类调节细胞周期的重要分子，它们与细胞衰老有着密切的关系。CKIs有两组家族：INK4家族和Cip/Kip家族。INK4家族由四个成员组成：p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c和p19INK4d。INK4家族的CKIs特异与CDK4-6结合并抑制其活性，从而影响CDKs使细胞周期分裂受阻。Cip/Kip是CKIs另外一个家族，它由三个成员组成：p21Cip1、p27Kip1和p57Kip2。已证实的与衰老发生相关的三条信号传导途径[5]p16INK4a/Rb、p19ARF/p53/p21Cip1、PTEN/p27Kip1，都与CKIs密切相关。
p16INK4a通过结合CDK4和CDK6，抑制它们磷酸化Rb，从而导致细胞G1期的阻滞。有研究表明，p16INK4a能够调节β-1,4-GalT的表达和活性[6]；p19ARF通过与Mdm2作用，激活细胞周期关键的检查点蛋白（checkpoint protein）p53，引起细胞周期G1和G2的的阻滞[7]。本实验中随转染β-1,4-GalT-I质粒浓度的增加p16INK4a和p19ARF的表达上调，提示β-1,4-GalT-I可通过p16INK4a和p19ARF所介导的信号传导途径参与调节雪旺氏细胞的增殖，这种调节作用可能与细胞衰老有关。而p27Kip1变化不明显，说明其在雪旺氏细胞的增殖调节中不发挥关键作用。
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